目的:预测分析紫草的质量标志物,为构建和完善紫草的质量标准提供参考.方法:搜索CNKI、pubmed、Web of science、万方等数据库的文献资料,对紫草的化学成分及药理作用进行总结归纳,并从植物亲缘学与化学成分特有性证据、传统药性药效、配伍规律、临床新用途和化学成分可测性等方面对其质量标志物(Quality marker,Q-Marker)进行预测分析.结果:紫草中主要含有萘醌类、多糖类、单萜苯酚及黄酮类等多种化学成分,现代药理研究表明紫草具有抗炎、抗肿瘤、保肝护肝和免疫调节等药理作用,并发现紫草传统功效及临床新用途相关的活性成分主要为多糖类及苯丙素类成分,并初步预测紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基-异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁等成分可作为紫草的Q-marker的候选物.结论:初步预测出紫草相关Q-Marker,以期为紫草药材质量的深入研究及综合运用提供参考.

目的 研究新疆紫草Arnebia euchroma的化学成分.方法 采用硅胶、ODS、凝胶柱色谱等多种柱色谱分离技术进行分离纯化,通过质谱、核磁共振波谱、圆二色谱等技术并结合文献报道的数据,对化合物进行结构鉴定.采用CCK8法,研究化合物对体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响.结果 从新疆紫草石油醚部位中共分离得到24个化合物,分别鉴定为(S)-1-(6-异丙基-2,3-二氢-1H-茚-4-基)乙-1-酮(1)、(Z)-2-(2-(2,5-二羟基苯基)-2-氧亚乙基)-6-甲基庚-5-烯酸乙酯(2)、2-(2Z)-(3-羟基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯基)-1,4-苯二醇(3)、新藏紫草酚(4)、(+)-(R)-脱氧碘化叶黄素(5)、3-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-6-羟基-9-甲氧基-2H-1-苯并氧杂环庚烯-5-酮(6)、对羟基苯甲醛(7)、香草醛(8)、乙酰香草酮(9)、2-羟基-4-甲氧基肉桂醛(10)、guttaquinol B(11)、岩大戟内酯E(12)、3-乙酰氧基齐墩果酸(13)、羟基何帕酮(14)、β-谷甾醇(15)、豆甾-4-烯-3,6-二酮(16)、麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(17)、柠黄醇(18)、euchroquinol B(19)、docosanyl ferulate(20)、arnebin-7(21)、阿卡宁(22)、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁(23)、异丁酰阿卡宁(24).化合物21、22对MCF-7细胞的增殖具有抑制作用,其半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC50)值分别为(16.58+0.02)μmol/L 和(9.19±0.02)μmol/L.结论 化合物1和2为新化合物,分别命名为新疆紫草酮(euchromone)和新疆紫草酚(euchromol).化合物7～11、16、18为首次从软紫草属中分离得到,化合物3和12为首次从新疆紫草中分离得到.化合物21、22具有良好的抑制MCF-7细胞增殖活性.

观察新疆紫草中乙酰阿卡宁对人黑色素瘤A375 细胞增殖、迁移和侵袭的影响,同时探讨其可能的作用机制.设空白组以及乙酰阿卡宁低、中、高剂量组(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)分别作用于A375 细胞.采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,细胞划痕及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测迁移侵袭相关N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、基质金属蛋白酶 9(MMP-9)以及Wnt/β-连环蛋白(β-cate-nin)通路相关Wnt1、轴蛋白2(Axin2)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)、β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21 蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶 2(MMP-2)、N-cadherin、vimentin、β-catenin、snail-1、CD44 mRNA表达情况.MTT结果显示,与空白组比较,乙酰阿卡宁各剂量组细胞抑制率显著上升(P<0.01).细胞划痕和Transwell实验结果显示,与空白组比较,乙酰阿卡宁各组细胞迁移、侵袭数量和迁移侵袭率显著降低(P<0.05,P<0.01),横、纵向迁移及侵袭能力明显减弱.Western blot结果显示,与空白组比较,乙酰阿卡宁高剂量组Axin2 蛋白表达增加(P<0.05),N-cadherin、vimentin、MMP-9、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、cyclin D1、p21蛋白表达均减少(P<0.05,P<0.01),GSK-3β蛋白表达无显著变化;PCR结果显示,MMP-2、N-cadherin、vimentin、β-catenin、snail-1、CD44 mRNA表达总体呈下降趋势(P<0.01),E-cadherin mRNA的表达升高(P<0.01).乙酰阿卡宁可抑制人黑色素瘤A375 细胞的增殖、迁移及侵袭,作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关.

目的 采用HPLC法测定新疆软紫草属4种植物(新疆紫草、黄花软紫草、天山软紫草、硬萼软紫草)根中7种萘醌类成分(左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、2-甲基丁基酰紫草素)的含有量.方法 该药材石油醚提取物的分析采用Agilent-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相乙腈-0.05％甲酸;体积流量l mL/ min;柱温30℃;检测波长275 nm.结果 7种成分在各自范围内线性关系良好,平均加样回收率为97.37％～ 99.75％,RSD为0.42％～1.94％.结论 该方法准确稳定,重复性好,可用于软紫草的质量控制.

目的:建立液相色谱串联质谱法测定紫草中醇溶性成分和水溶性成分(左旋紫草素,β,β’-二甲基丙烯酰阿卡宁,β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁,紫草酸,咖啡酸,迷迭香酸)的含量,用于紫草的质量控制.方法:采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(4.6 mm×50 mm,1.8 μm),以0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～3 rmin,5％～95％A;3～7 min,95％A;7～7.01 min,95％～5％A;7.01 ～ 8.50 min,5％A);流速0.2 mL· min-1,柱温35℃,进样量5 μL;采用负离子电离模式,MRM扫描模式进行定量.结果:左旋紫草素,β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁,β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁,紫草酸,咖啡酸,迷迭香酸分别在10.12～1012 μg· L-1(r=0.9981),10.88～1088 μg·L-1 (r=0.9912),10.08～806.4 μg·L-1(r =0.9976),20.32～1016 μg·L-1(r =0.9966),10.37～1037μg·L-1(r=0.9996),10.26 ～1026 μg·L-1(r =0.9978)均有良好线性关系(r≥0.9912);平均加样回收率分别为95.8％(RSD 3.2％),103.5％ (RSD2.3％),105.3％(RSD 2.1％),96.1％ (RSD 3.3％),98.9％(RSD 2.7％),100.8％(RSD 3.4％).13批次紫草样品中6个种成分含量存在较大差异.结论:所建立的方法合理可行,为综合评价紫草质量提供一定依据.

目的:建立新疆紫草的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,进行化学模式识别分析,并测定其中3种成分的含量.方法:采用HPLC法.以乙酰紫草素为参照,绘制34批不同来源新疆紫草药材样品的HPLC指纹图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)》进行相似度评价,确定共有峰;采用SPSS 19.0、SIMCA 14.1统计软件进行聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析,以变量投影重要性值大于1为标准,筛选影响新疆紫草药材质量的差异标志物,并以相同HPLC法测定其中3种成分的含量.结果:34批新疆紫草药材共有12个共有峰;除市售样品中的3批药材相似度低于0.72外,其余药材的相似度均高于0.86;共指认出左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁等3个共有峰.34批新疆紫草药材可聚为2类,其中S1、S4～S6、S13、S15～S20、S22、S26～S34聚为一类,其余聚为一类.前3个主成分因子的方差贡献率分别为52.834％、18.600％、8.387％,累积方差贡献率为79.821％.左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁等6个成分为影响其质量的差异标志物.左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁检测质量浓度的线性范围分别为0.72～90、2.05～410、2.50～500μg/mL(r均大于0.999);定量限分别为0.132、0.135、0.118μg/mL,检测限分别为0.040、0.041、0.036μg/mL;精密度、稳定性(24 h)、重复性、耐用性试验的RSD均小于3％;加样回收率分别为95.959％～100.201％(RSD=1.669％,n=6)、97.818％～102.698％(RSD=1.788％,n=6)、95.831％～99.344％(RSD=1.600％,n=6).含量分别为0.002％～0.134％、0.025％～1.388％、0.022％～0.881％.结论:所建HPLC指纹图谱和含量测定方法简便、稳定性好,可用于新疆紫草药材的质量评价和定量分析;左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁等成分的含量各有不同,为不同来源新疆紫草的差异标志物.

该研究依托新疆紫草悬浮细胞转录组数据库,以CYP76B74蛋白序列为搜索序列,挖掘了2条与紫草素生物合成下游途径相关的CYP450候选基因.构建了候选基因的干扰型毛状根并进行培养,测定了鲜重、干重、总萘醌含量、紫草素类化合物含量以及紫草素生物合成途径关键酶基因的表达量,初步探究了候选基因对新疆紫草毛状根的生长和紫草素合成产生的影响,并讨论了其影响紫草素合成的可能调控机制.通过本地Blast和系统发育分析,筛选出2条新疆紫草中与CYP76B74具有高同源性的CYP450候选基因(CYP76B75,CYP76B100),并构建了相应的干扰型毛状根.相比空载毛状根(RNAi-control),CYP76B75被干扰毛状根(RNAi-CYP76B75)和CYP76B100被干扰毛状根(RNAi-CYP76B100)的鲜重显著减少,而干重未受到影响,折干率显著增加.除β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁在3组毛状根中含量都很高外,紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异丁酰紫草素以及总萘醌在3组毛状根中的含量高低均呈现一致规律:RNAi-CYP76B75＞RNAi-CYP76B100＞RNAi-control.其中,干扰CYP76B75表达后对-羟基异戊酰紫草素合成的促进作用最显著,RNAi-CYP76B75中β-羟基异戊酰紫草素的含量为RNAi-control的11.7倍.实时荧光定量PCR结果显示,与RNAi-control 相比较,RNAi-CYP76B75与RNAi-CYP76B100中AePGT基因的表达量无明显变化,CYP76B74与AeHMGR的表达量上调;此外,RNAi-CYP76B75中,CYP76B100的表达量下调,而RNAi-CYP76B100中,CYP76B75的表达量反而显著上调.结果 说明CYP76B75与CYP76B100被干扰表达后,毛状根的生长受到了抑制,但却显著促进了其紫草素的合成,其可能通过上调新疆紫草毛状根中CYP76B74基因的表达量调控了紫草素生物合成.

目的:采用一测多评(QAMS)与特征图谱结合的方法测定紫草中8个羟基萘醌(紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素)的含量,并验证方法的准确性.方法:采用HPLC特征图谱进行色谱峰定位,并以乙酰紫草素为参照物,建立其对紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素的相对校正因子,用该校正因子进行相应成分的含量计算,实现一测多评;同时采用外标法测定新疆紫草中8个羟基萘醌的含量,并比较计算值与实测值的差异,以验证一测多评法的准确性和可行性.色谱条件:采用Agilent ZOBAX XDB-Eclipse色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.05％甲酸水溶液(70: 30),流速1.0 mL· min-1,柱温30℃,检测波长275 nm,进样量10 μL.结果:建立新疆紫草的特征图谱,标定了8个特征峰;12批样品色谱图的相似度均大于0.90.紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素进样量分别在1.032～412.8 μg·mL-1(r=0.999 9)、1.002～400.8 μμg·mL-1(r=0.999 8)、1.032～412.8 μg·mL-1(r=0.999 9)、1.053～421.2 μg· mL-1(r=0.999 9)、1.016～406.4 μμg· mL-1(r=0.999 8)、1.045～418.0 μg· mL-1(r=0.999 9)、1.030～412.0 μμg· mL-1(r=0.999 9)和1.007～402.8 μg·mL-1(r=0.999 9)范围内呈现良好线性关系;平均加样回收率(n=6)分别为98.4％(RSD=1.8％)、97.9％(RSD=1.9％)、98.6％(RSD=1.2％)、99.3％(RSD=1.6％)、101.1％(RSD=1.9％)、98.6％(RSD=1.3％)、99.0％(RSD=1.2％)和100.4％(RSD=1.4％).紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素相对于乙酰紫草素的相对校正因子分别为1.263、1.161、0.938、1.840、1.039、1.138和0.932;且在不同实验条件下重现性良好(RSD＜3.0％);一测多评法的计算结果与外标法实测值之间无显著差异.12批新疆紫草中紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素的含量范围分别为0.063％～0.222％、0.011％～0.053％、0.571％～1.621％、0.105％～0.364％、0.011％～0.059％、0.349％～0.727％、0.578％～1.353％和0.720％～ 1.761％.结论:建立的一测多评法结合特征图谱可用于新疆紫草中8个羟基萘醌类化学成分的含量测定,有效控制新疆紫草质量.

目的 建立HPLC法同时测定紫白栓(紫草、大黄、白及等)中贝母兰宁、山药素Ⅲ、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的含有量.方法 该药物70％甲醇提取液的分析采用Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相乙腈-0.1％甲酸,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长254、275 nm.结果 9种成分在各自范围内线性关系良好(r≥0.999 1),平均加样回收率96.98％～100.03％,RSD 0.72％～1.64％.结论 该方法简便、准确、可靠,可用于紫白栓的质量控制.

目的:通过网络药理学及分子对接技术初步预测新疆紫草治疗黑色素瘤的活性成分、作用靶点及信号通路,通过体外实验验证可能的作用机制.方法:通过中药系统药理学数据库(TCMSP),成分靶点预测数据库(SwissTargetPrediction)以及查阅文献获取新疆紫草药理作用的活性成分及相关靶点;通过GeneCards,在线人类孟德尔遗传病数据库(OMIM),毒性与基因比较数据库(CTD)获取黑色素瘤相关靶点;使用STRING数据库构建活性成分与相关靶点的新疆紫草-黑色素瘤靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图;利用Cytoscape 3.8.2软件对新疆紫草抗黑色素瘤网络节点进行筛选分析;使用DAVID 6.8数据库对交集靶点进行基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.选取新疆紫草中活性成分乙酰阿卡宁和靶点通过AutoDock vina 1.1.2软件进行分子对接验证;利用体外细胞实验验证药物抗黑色素瘤的作用.结果:预测显示,新疆紫草与黑色素瘤共同靶点271个,其中关键靶点23个,包括基质金属蛋白酶(MMP)-9,Janus激酶(JAK)2等;KEGG富集分析预测新疆紫草治疗黑色素瘤主要作用于JAK信号转导与转录激活蛋白(STAT),酪氨酸激酶受体(ErbB),血管内皮生长因子(VEGF)等信号通路;分子对接显示新疆紫草中活性成分乙酰阿卡宁与JAK2,STAT3,VEGF,MMP-9,上皮钙黏蛋白(E-cadherin)受体表现出良好的对接活性;体外蛋白免疫印迹与实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果表明,不同剂量的乙酰阿卡宁能抑制A375细胞JAK2,STAT3,VEGF,MMP-9,E-cadherin蛋白与基因的表达(P＜0.05).结论:新疆紫草治疗黑色素瘤具有多靶点、多通路的特点,其发挥治疗作用机制可能与影响JAK2,STAT3,VEGF,MMP-9,E-cadherin等关键靶点蛋白的表达,进而抑制黑色素瘤细胞侵袭和转移能力有关.该研究为新疆紫草抗肿瘤提供了实验依据.