目的 研究黑果小檗内生真菌假丝酵母菌Candida sp.的次生代谢产物.方法 假丝酵母菌发酵提取物次级代谢产物的乙酸乙酯部位、石油醚部位采用硅胶、Sephadex LH-20、制备液相色谱进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构.结果 从中分离得到 18 个化合物,分别鉴定为 1-苯基-1,2-乙二醇(1)、4-羟基苯乙醇(2)、4-羟基苯甲酸(3)、对羟基苯乙酸(4)、间羟基苯乙酸(5)、3-甲基亚砜基丙酸(6)、苯乙酸(7)、(S)-N-nitroso-1-amino-p-hydroxy phenylethanol(8)、2-苯乙酰胺(9)、对羟基苯甲醛(10)、2-(4-羟苯基)-乙酸乙酯(11)、邻苯二甲酸二丁酯(12)、5,5'-dimethoxybiphenyl-2,2'-diol(13)、3-吲哚甲醛(14)、N-乙酰-L-苯丙氨酸(15)、9-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic acid(16)、9-hydroxy-10E,12E-octadecadienoic acid(17)、(6E)-5-methylene-6-tetradecenoic acid(18).结论 化合物 1、3～8、10～18 为首次从假丝酵母菌真菌中分离得到.

[目的]为实现生物合成重要化合物 2-萘乙醇,探索利于 2-萘乙醇合成的基因组合.[方法]向酿酒酵母BY4741发酵液中外源添加 2-萘丙氨酸,运用高效液相色谱法进行产物检测;绘制BY4741 的生长曲线和产量曲线,添加不同浓度 2-萘丙氨酸到BY4741 发酵液中并检测BY4741 生长和生产情况;对BY4741 进行代谢工程改造,构建过表达Ehrlich途径 6 个基因的质粒并转化进BY4741 中;发酵 6 株改造菌株,检测产物产量.[结果]发酵液中检测到了推测产物 2-萘乙醇,代谢工程改造菌株相较于野生型BY4741 菌株产量均有所提升,其中过表达ARO9和ARO10基因使得 2-萘乙醇的产量在外源添加 1 mmol/L 2-萘丙氨酸的情况下达到 0.258 mmol/L,转化率达到野生型的 2.3 倍.[结论]在酿酒酵母中实现了 2-萘乙醇的生物合成,探索出ARO9 和ARO10 是利于 2-萘乙醇生物合成的基因组合,为工业生产 2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法.

[目的]为选育出高度耐酸性酒酒球菌(Oenococcus oeni)突变菌株,研究其胁迫耐受性能及苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)能力.[方法]以酒酒球菌SD-2a为出发菌株,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术,筛选高耐酸性酒酒球菌突变菌株,并探究其乙醇耐受性及在模拟酒和葡萄酒条件下的MLF能力.[结果]经过ARTP诱变处理后,利用pH 3.0的胁迫传代培养和分离纯化等,获得了 5株p-葡萄糖苷酶活性较好的耐酸突变菌株,且在高乙醇浓度下表现出了较好的耐乙醇性.其中突变菌株ARTP-2在模拟酒中的β-葡萄糖苷酶活性和L-苹果酸累积降解量最高,且其在葡萄酒中L-苹果酸降解速率快于出发菌株,在第18天完成MLF,发酵后的葡萄酒香气成分的含量显著高于接种SD-2a的酒样.[结论]突变菌株ARTP-2具有良好的胁迫耐受性和MLF能力,对葡萄酒的香气起到积极的作用,为进一步开发优质的MLF商业发酵剂奠定基础.

脂质是灵芝重要活性成分之一,但目前对灵芝胞内脂质成分的构成研究甚少.本研究采用UPLC-ESI-MS/MS技术,对灵芝发酵菌体的胞内脂质构成进行分析.结果显示,灵芝细胞中共鉴定到296种脂质,其中甘油酯112种、磷脂148种、鞘脂34种和甾醇2种;甘油酯和磷脂分别占总脂质的 44.70%和 38.06%,鞘脂和甾醇分别占总脂质的 17.08%和 0.16%.分析甘油酯中主要成分为甘油三酯,占甘油酯总含量的 67.36%;磷脂中主要成分为磷脂酰乙醇胺,占磷脂总含量的 62.64%;鞘脂中主要成分为神经酰胺,占鞘脂总量的 60.33%;此外,本研究检测出 27 种游离脂肪酸,其中20 种为不饱和脂肪酸,相对含量为 65.59%;7 种为饱和脂肪酸,相对含量为 34.41%.本研究系统性地分析了灵芝细胞中的脂质构成,为进一步开展灵芝细胞中脂质相关研究奠定基础.

旨在构建优良的高温耐受酿酒酵母菌株,并探究其高温耐受机制.通过CRISPR/Cas9 技术在絮凝性工业酿酒酵母KF-7 中敲除ASP3(编码 L-天冬酰胺酶Ⅱ)并进一步高表达CRZ1(编码具有锌指结构的转录因子Crz1p),通过比较转录组解析重组菌株的高温耐受机制.结果显示,在 44℃高温条件下,ASP3 敲除菌株KAS11 利用 98.36 g/L葡萄糖产生 43.68 g/L乙醇.在KAS11 基础上高表达CRZ1 后,菌株KASCR7 发酵 105.37 g/L葡萄糖产 48.02 g/L乙醇.与KF-7 相比,两个重组菌株的乙醇产量分别提升了 4.77%和 15.18%.比较转录组分析结果表明,在高温胁迫下,重组菌株的核糖体生物合成及翻译相关基因受到抑制,而热休克蛋白基因以及NAD+、NADH、嘌呤、甘油、脯氨酸等合成相关基因受到诱导,这些响应可能共同导致重组菌株的高温耐受性提升.研究结果可为构建高温耐受酿酒酵母菌株提供优良菌株资源和理论基础.

纤维素乙醇作为一种清洁可再生的绿色能源,具有良好的应用前景.然而酿酒酵母利用木质纤维素原料生产乙醇的发酵过程易受多种抑制物胁迫的影响,因此提高其胁迫耐受性具有重要意义.本研究在细胞内设计了一种氧化还原敏感型基因元件,通过生物传感器Yap1 感应胞内氧化还原状态,以调控抗胁迫基因智能表达.首先,分析了Yap1 调控的天然内源启动子PTRR1、PTRX2 和PMET16 对木质纤维素水解液中典型抑制物的响应强度.其次,根据不同胁迫种类组合相应启动子与抗胁迫的效益基因,构建氧化还原敏感型基因元件提高了酿酒酵母的胁迫耐受性.最后,将表现较好的基因元件GP-CTT和GP-ADH串联整合到一起构建了双基因元件系统,在 5-HMF和H2O2 双重胁迫下细胞的死亡率与野生型相比下降了 69.6%.相较于单基因元件GP-CTT,双基因元件整合菌株的比生长速率、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率分别提高了64.2%、60.1%和 58.9%,重组菌株过氧化氢酶的酶活力提高了 40.2%.本研究通过理性设计氧化还原敏感型基因元件的遗传回路,强化胞内关键抗氧化酶和醛降解途径,系统地提高了酿酒酵母的胁迫耐受性,为动态地提高酵母鲁棒性提供了新的见解.

目前,绝大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株利用菊糖生产乙醇的能力有限,而蔗糖转化酶Suc2 是酿酒酵母水解菊糖的关键酶,其分泌水平直接影响酿酒酵母转化菊糖为乙醇的性能.为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶Suc2 的分泌表达水平,利用生物信息学的分析方法选择出 11 种不同的分泌信号肽,包括酿酒酵母内源性、其他菌株来源以及已报道序列优化改造的信号肽,将它们融合至Suc2 并构建了相应的酿酒酵母BY4741 重组菌.其中,酿酒酵母内源分泌信号肽AGA2 能使蔗糖转化酶Suc2 更有效的分泌,含有信号肽AGA2 的重组菌BY-AG的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活相对于含有天然信号肽的原始菌BY-S分别提高 42%和26%,其利用菊糖产乙醇能力较原始菌提高了32%,乙醇产量达到78.11 g/L.在使用毕赤酵母(Pichia pasto-ris)分泌信号肽MSB2 时,蔗糖转化酶Suc2 的分泌水平也有提高,含有信号肽MSB2 的重组菌BY-MS较原始菌BY-S的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活分别提高了80%和74%,同时,利用菊糖产乙醇能力也提高了56%,产量达到86.31 g/L.最后,对重组菌BY-MS摇瓶发酵过程中的生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量和乙醇产量进行了监测,结果表明,重组菌BY-MS的发酵性能较原始菌BY-S有显著提高.本研究为提高蔗糖转化酶Suc2 的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考.

[背景]丝状真菌是一类重要的工业发酵生产宿主菌,如何进行高通量纯菌培养和高效检测筛选性能优异的菌株是工业丝状真菌研究的重要方向.[目的]研究建立丝状真菌的高通量培养技术并测试应用效果.[方法]通过对丝状真菌培养过程中的制种、接种、培养和检测研究,建立基于孔板的高通量培养技术,并以嗜热毁丝霉为例对该技术进行验证.[结果]与传统的平板制种和摇瓶接种培养方式相比,高通量孔板的培养方式将制种通量提高 24 倍,单位面积产孢子能力提高 350%,液体培养转接效率提高 10-40 倍,并建立 96 孔板测定乙醇含量的高通量检测技术.[结论]将丝状真菌的培养和检测通量提高 1-2 个数量级,为快速检测丝状真菌改造过程产生的大量性状不同菌株并获得目标菌株奠定基础,为丝状真菌高通量筛选研究提供应用指导价值.

[背景]商业酵母的使用造成葡萄酒同质化问题严重,发掘优良本土酿酒酵母具有十分重要的意义.[目的]从 168 株宁夏本土酿酒酵母菌株中筛选出性能优良、具有出色葡萄酒发酵能力的菌株.[方法]基于杜氏管发酵试验和乙醇、高糖等耐受性试验分析产H2S能力及生长曲线测定的方法,筛选出发酵力好、耐受性强、低产 H2S 的本土酿酒酵母进行赤霞珠葡萄酒发酵试验,测定葡萄酒样基础理化指标、酚类物质和挥发性成分,探究筛选出的酿酒酵母发酵特性.[结果]初步筛选出发酵快速,能适应 13%乙醇、350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH 1.0 的生存环境且低产H2S的 4 株本土酿酒酵母 YC-E8、QTX-D17、QTX-D7、YQY-E18.菌株 YC-E8 产甘油能力强,所发酵酒样香气与商业酵母 XR、F33 最为接近,适用于赤霞珠葡萄酒的发酵.菌株 QTX-D17 发酵酒样中酒精、单宁、总酚和花色苷含量最高,表现出本土酿酒酵母优良的发酵特性.菌株QTX-D7所发酵酒样香气中乙酸乙酯、辛酸乙酯、1-壬醇等物质含量较高,赋予了葡萄酒香蕉味、苹果味、菠萝味、椰子味等愉悦花果香.[结论]最终筛选出 3 株优良本土酿酒酵母 QTX-D17、YC-E8 和QTX-D7,其酿酒特性风格不一,有潜力酿造产区特色葡萄酒,为宁夏贺兰山东麓产区的酿酒微生物资源开发提供参考价值.

蜜环菌(Armillaria mellea)是药用植物天麻(Gostrodia elata)营养生长阶段的共生真菌.为研究蜜环菌的化学成分和生物活性,本实验综合运用MCI树脂、正相硅胶、Sephadex LH-20凝胶及半制备RP-HPLC等色谱分离技术对蜜环菌发酵液及其菌丝体的95％乙醇提取物进行系统分离,得到26个化合物.根据化合物的理化性质和波谱数据,分别鉴定为十四烷酸(1)、α-亚麻酸(2)、油酸(3)、亚油酸(4)、亚油酸乙酯(5)、8(R),11(S)-二羟基-9Z,12Z-十八烷二烯酸(6)、2-油酰甘油(7)、1-亚油酸甘油酯(8)、二羟丙基-油酸(9)、亚油酸甲酯(10)、甘油1,3-二亚油酸酯(11)、(5Z,9Z)-17-甲基-非十七烯酸-5,9-二酯(12)、(2S)-α-(9'Z,12'Z,15'Z)-十八碳三烯酸(13)、麦角甾醇(14)、(22E,24S)-5α,8α-环二氧-6,22-麦角甾二烯-3β醇(15)、对羟基苄基乙基醚(16)、尿嘧啶(17)、环D-脯氨酸-D-异亮氨酸(18)、环D-脯氨酸-D-亮氨酸(19)、环D-脯氨酸-D-苯丙氨酸(20)、脯氨酸(21)、环D-脯氨酸-L-缬氨酸(22)、环D-脯氨酸-D-缬氨酸(23)、4-(2-羟乙基)-5-甲基噁唑(24)、环丙氨酸-缬氨酸(25)、环丙氨酸-脯氨酸(26).其中,化合物5～13、16和18～26是首次从蜜环菌中分离获得.体外生物活性研究表明化合物14和15对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应具有抑制作用.