目的:通过生物信息学分析探究儿童神经母细胞瘤中与MYCN(N-myc)基因相关的共表达基因。方法:下载TARGET数据库神经母细胞瘤表达数据共179例，WGCNA分析筛选MYCN扩增共表达基因模块；针对目标基因模块个基因行GO、KEGG富集分析筛选MYCN扩增相关基因可能参与生物过程及信号通路；以MYCN扩增状态将神经母细胞瘤表达数据分为扩增组65例、非扩增组114例，行差异表达基因分析；筛选的差异表达基因同MYCN扩增相关基因取交集后运用K-M法行生存分析(log-rank检验)，筛选预后相关基因，Logistics回归探究MYCN扩增状态同预后基因的关系。结果:WGCNA分析提示MEgreenyellow模块同MYCN基因扩增状态相关性最强( R＝0.46， P<0.05)，为共表达基因，包含基因1 216个，富集分析提示MYCN扩增共表达基因多参与RNA相关通路(RNA的转运、剪切、修饰，RNA相关酶的活性等过程)；差异表达基因分析显示，MYCN扩增组相较于非扩增组，基因表达上调47个，表达下调123个；WGCNA分析同差异表达基因取交集筛选出22个关键基因，行生存分析显示同预后相关的基因( P<0.05)有12个，其中DDX1与其他关键基因相关性相对较弱，或为神经母细胞瘤独立预后因素。 结论:LINC00839、ATP结合盒亚家族C4(ABCC4)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP +依赖)2(MTHFD2)、磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)、序列相似性家族13 A(FAM11A)、磷酸丝氨酸转氨酶1 (PSAT1)、假尿苷酸合酶7(PUS7)、DEAD-box解旋酶1(DDX1)、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族5A1(SLCO5A1)、Junctophilin 1(JPH1)、溶质载体家族16 1(SLC16A1)、MYCN Opposite Strand(MYCNOS)为神经母细胞瘤中MYCN扩增的共表达基因，与较差的预后相关，是神经母细胞瘤潜在的治疗靶点及预后指标。

目的·探究叶酸循环代谢对髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)免疫抑制作用的调控机制.方法·在C57BL/6小鼠骨髓细胞的培养体系中加入细胞因子粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),体外诱导MDSCs.利用流式细胞仪检测诱导MDSCs的程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)表达水平和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生水平.采用磁珠分选出小鼠脾脏CD8+T细胞并用Celltrace violet或CFSE标记,再与MDSCs共培养,72 h后用流式细胞术检测CD8+T细胞增殖情况.通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测MDSCs中叶酸循环相关代谢酶的表达水平.采用叶酸循环代谢酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶 2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2)抑制剂DS18561882(DS18)和叶酸拮抗剂培美曲塞(Pemetrexed)处理MDSCs,并用流式分析检测MDSCs产生ROS和线粒体ROS的水平.将DS18或培美曲塞处理后的MDSCs与磁珠分选出来并用Celltrace violet或CFSE标记的CD8+T细胞共培养,72 h后用流式细胞术检测CD8+T细胞增殖情况.利用RNA测序(RNA-seq)检测DS18和培美曲塞处理后MDSCs在转录组水平的变化.建立小鼠结肠癌(mouse colon cancer cells,MC38)和Lewis 肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)皮下瘤模型.造模后第10天开始,采用Isotype抗体、抗CD8单抗(1 mg/kg,清除CD8+T细胞)、培美曲塞以及抗CD8单抗联合培美曲塞处理MC38荷瘤小鼠;利用Isotype抗体、抗Gr1单抗(1.25 mg/kg,清除MDSCs)、培美曲塞以及抗Gr1单抗联合培美曲塞处理MC38荷瘤小鼠;分别给予MC38和LLC荷瘤小鼠培美曲塞(50 mg/kg)、抗PD-1单克隆抗体(250 μg/kg)以及培美曲塞联用抗PD-1单克隆抗体治疗;第14天收集小鼠肿瘤组织,记录肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线.结果·流式结果显示诱导后的骨髓细胞PD-L1的表达升高,ROS的产生也增加,且明显抑制CD8+T细胞的增殖.qPCR结果显示MDSCs中叶酸循环相关代谢酶MTHFD2等表达升高.给予DS18和培美曲塞处理MDSCs会影响MDSCs的累积,抑制MDSCs的ROS产生,并解除对CD8 T细胞的免疫抑制.RNA-seq结果表明2种叶酸循环抑制剂处理后,与MDSCs分化相关基因S100钙结合蛋白a8(S100 calcium binding protein a8,S100a8)等下调,与MDSCs抑制功能相关基因如与ROS产生有关的基因细胞色素b-245β链(cytochrome b-245 beta chain,Cybb)等也有所下调.与对照组相比,培美曲塞处理组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制.与培美曲塞处理组相比,抗CD8单抗联合培美曲塞处理组肿瘤进展加剧;与抗CD8单抗处理组相比,抗CD8单抗联合培美曲塞处理组肿瘤进展受到限制.清除MDSCs能显著抑制肿瘤生长,然而在清除MDSCs的荷瘤小鼠中,培美曲塞的抗肿瘤作用显著低于培美曲塞单独处理的小鼠.与抗PD-1抗体单独治疗相比,培美曲塞联用抗PD-1抗体治疗组的肿瘤生长限制更为显著.结论·培美曲塞依赖CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用,并通过重编程MDSCs为抗肿瘤表型,进一步阻碍肿瘤生长.通过调控MDSCs叶酸循环阻断其免疫抑制能力,可增强免疫检查点阻断剂治疗肿瘤效果.

异质性细胞叠套结构(heterotypic cell-in-cell structure,heCICs)介导独特的非自主性细胞死亡,广泛参与肿瘤发生、发展和临床预后等多种重要的病理学过程.亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(methylenetetrahydrofolata dehydrogenase 2,MTHFD2)作为一碳代谢的关键酶之一,在多种肿瘤细胞中高表达.在本研究中,为了探究MTHFD2对heCICs形成能力的影响,首先应用活细胞染料对肝癌细胞和免疫细胞分别进行标记,利用荧光显微镜对细胞进行拍摄分析建立heCICs模型.进一步通过RNAi技术瞬时敲低细胞中的MTHFD2,结果显示,MTHFD2敲低后,PLC/PRF/5和Hep3B分别与免疫细胞形成heCICs的能力显著升高(均P＜0.01).通过同源重组方法构建MTHFD2重组表达质粒,进一步构建MTHFD2过表达细胞系;将过表达细胞系与免疫细胞共培养检测MTHFD2过表达对heCICs形成能力的影响,结果显示,过表达MTHFD2后heCICs形成率显著降低(均P＜0.001).综上,本研究表明,MTHFD2是heCICs形成的负调控因子,为靶向MTHFD2促进heCICs形成增强免疫细胞胞内杀伤提供了研究基础.

目的 采用生物信息学分析技术探讨亚甲基四氢叶酸脱氢酶 2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2)在头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中的表达、生物学功能、相关信号通路、肿瘤突变负荷、免疫细胞浸润及其与患者预后的关系.方法 在癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中比较人HNSCC组织和正常组织中MTHFD2基因mRNA的相对表达水平,根据HNSCC患者癌组织中MTHFD2基因表达中位数分为高、低表达组,绘制Cox比例风险模型,Log-rank检验比较MTHFD2 高低表达组患者总生存期(OS)有无差异;对MTHFD2及相关基因功能进行KEGG和GO信号通路功能富集;使用R语言与maftools软件包分析MTHFD2与肿瘤突变负荷的相关性;使用TIMER 2.0相关模块分析癌组织肿瘤浸润情况.结果 MTHFD2基因mRNA在癌组织表达水平高于癌旁正常组织(P＜0.05),随着MTHFD2基因mRNA表达水平的增高,HNSCC的分期增加(P＜0.05),OS缩短(P＜0.05);GSEA发现MTHFD2与细胞周期控制过程密切相关;MTHFD2的体细胞突变率为0.59%,且与肿瘤突变负荷显著相关(P＜0.001);MTHFD2高表达时,NK CD56 bright细胞、T辅助细胞和Th2细胞显著上升.结论 MTHFD2可能作为HNSCC的预后性生物标志物,并可能在肿瘤浸润免疫细胞中发挥关键作用.

目的 慢性阻塞性肺疾病(COPD)中亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(MTHFD2)基因的表达水平对胞外陷阱(NET)的形成和糖酵解代谢的影响.方法 通过生物信息学探寻MTHFD2与糖酵解和中性粒细胞(NEU)标志物之间的相关性,随后利用Picogreen染色实验检测胞外DNA含量.免疫荧光染色检测中性粒细胞胞外陷阱(NET)相关标志物MPO和cit-H3的表达水平.qRT-PCR检测 MTHFD2、糖酵解相关基因(HK1、PDK1、SLC2A1、MYC)的表达量.细胞分子实验分别检测NC中性粒细胞、过表达 MTHFD2的中性粒细胞、过表达 MTHFD2+糖酵解抑制剂(2-DG)的中性粒细胞中NET的形成水平以及葡萄糖和乳酸的含量.结果 MTHFD2在COPD患者组织高表达,与糖酵解通路相关基因、中性粒细胞标志物的表达呈正相关.免疫荧光染色和Sytox Green染色实验显示COPD中NET水平显著上调.细胞分子实验结果显示过表达 MTHFE2可诱导HK1、PDK1、SLC2A1、MYC的表达,促进葡萄糖分解成乳酸,进而促进中性粒细胞NET形成.结论 本研究探讨了 MTHFD2基因对中性粒细胞的NET形成和糖酵解代谢的影响,分析了 MTHFD2通过糖酵解促进COPD患者NET形成的相关机制,为COPD患者的治疗提供新型潜在诊断标志物和治疗靶点.

目的 探究新生儿出生缺陷与叶酸代谢产物及关键酶基因多态性的关系.方法 选择2018 年3 月—2022 年9 月产下出生缺陷新生儿的产妇174 例及产下健康新生儿产妇 150 例,分别作为研究组及对照组.收集 2 组产妇一般资料,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶1 基因G1958A位点、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因 C677T 及 A1298C 位点、甲硫氨酸合成酶基因 A2756G 位点、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因A66G位点、细胞膜还原叶酸转运载体(RFC)基因A80G位点基因多态性,分析产妇各基因多态性与新生儿出生缺陷的关系.结果 研究组MTRR基因A66G位点G等位基因、RFC基因A80G位点G等位基因比例高于对照组(P＜0.05,P＜0.01).MTRR基因A66G位点基因型在显性、共显性模型下差异有统计学意义(P＜0.01);RFC基因A80G位点在隐性、共显性模型下差异有统计学意义(P＜0.05).MTRR基因A66G位点、RFC基因A80G位点联合分析显示,AA/GG型、AG/AG型与纯合子AA/AA型比较差异有统计学意义(P＜0.01).多因素Logistic回归分析显示,孕期叶酸服用史、MTRR基因A66G位点多态性、RFC基因A80G位点多态性是出生缺陷的独立危险因素(P＜0.05,P＜0.01).结论 叶酸代谢相关基因MTRR、RFC与新生儿出生缺陷相关,临床可通过检测母体相关基因多态性,评估叶酸利用能力,进而评估新生儿出生缺陷的发生风险.

亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2)是线粒体一碳叶酸代谢的关键酶之一.MTHFD2在肿瘤中呈高表达,MTHFD2表达升高与患者预后不良及肿瘤耐药性相关.敲低MTHFD2明显抑制体外细胞增殖、迁移、侵袭以及体内肿瘤的生长、转移等多种恶性表型.这些研究表明MTHFD2与肿瘤的发生发展密切相关.本文将从MTHFD2与肿瘤的关系,MTHFD2对肿瘤细胞的酶促和非酶促作用,MTHFD2在肿瘤中的调控以及其抑制剂的相关研究进展等方面进行文献综述.

高山被孢霉是一种富含多不饱和脂肪酸的丝状真菌,但其脂质过程中NADPH的来源还没有研究透彻.以高山被孢霉(尿嘧啶营养缺陷型)作为出发菌株,研究亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD1)对高山被孢霉脂质合成的影响.首先构建了过表达载体pBIG2-ura5 s-MTHFD1,采用根癌土壤杆菌介导转化真菌的方法,将二元表达载体转化进高山被孢霉CCFM501中,在筛选培养基SC-CS平板上进行筛选,进而得到稳定遗传MTHFD1基因的过表达菌株(MA-MTHFD1);其次提取MA-MTHFD1菌株基因组进行PCR鉴定,并结合qPCR分析结果,表明MTHFD1基因成功在高山被孢霉中实现了过量表达;最后通过对MA-MTHFD1中的脂肪酸含量、NADPH含量及NADPH合成途径中相关基因转录水平进行分析,研究MTHFD1基因过表达对脂质合成的影响.实验结果表明,过表达MTHFD1基因可以提高高山被孢霉脂质合成能力.与原养型高山被孢霉相比,MA-MTHFD1菌株中脂肪酸含量提高了40.13％,NADPH的含量提高了26.45％,而且NADPH合成途径中其他相关基因苹果酸酶(ME)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的转录水平也发生了上调.这一系列研究结果表明,在高山被孢霉脂质合成还原力形成中,MTHFD1基因起到了关键作用.这为解析高山被孢霉中NADPH来源及深入研究脂质合成机制,从而对其胞内脂肪酸代谢通路进行分子水平上的改建提供了一定的理论依据.

目的 研究叶酸代谢通路中关键酶单核苷酸多态性(SNPs)与中国北方汉族儿童神经管缺陷(NTDs)的相关性.方法 以中国北方汉族152例NTDs患儿和169例对照者为研究对象进行病例-对照研究.采用Sequenom MassARRAY SNP分型技术对5个基因的16个SNPs位点进行基因分型.应用SIFT和PolyPhen 程序预测评价点突变对蛋白质功能的影响.结果 亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(MTHFD1)基因rs2236225位点等位基因和基因型频率在病例组和对照组中的分布差异具有统计学意义(x2=5.292、6.080;P=0.021、0.048),且A等位基因和AA基因型携带儿童发生NTDs的风险高于G等位基因和GG基因型携带者(OR=1.500,95％ CI 1.061～2.120;OR=2.862,95％ CI1.022～8.015).亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因rs1801133位点等位基因和基因型频率在病例组和对照组中的分布差异具有统计学意义(x2=7.403、6.973;P =0.007、0.031),且T等位基因和TT基因型携带儿童发生NTDs的风险高于C等位基因和CC基因型携带者(OR=1.552,95％ CI1.130～2.131;OR=2.344,95％ CI1.233 ～4.457);甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因rs1801394位点等位基因和基因型频率在病例组和对照组中的分布差异具有统计学意义(x2=6.365、6.219;P=0.012、0.045),且G等位基因和GG基因型携带儿童发生NTDs的风险高于A等位基因和AA基因型携带者(OR=1.553,95％CI 1.102 ～2.188;OR =2.355,95％ CI1.044 ～5.312).MTHFR基因rs1801133和MTRR基因rs1801394的SIFT预测结果为damaging,PolyPhen预测结果为probably damaging,均提示为有害突变.结论 MTHFD1基因rs2236225、MTHFR基因rs1801133及MTRR基因rs1801394位点多态性与中国北方汉族儿童NTDs发生具有相关性,证实叶酸代谢通路中关键酶基因的变异是NTDs遗传易感性因素之一.

目的 探讨神经管缺陷(NTDs)家系中全基因组DNA甲基化改变情况及其意义.方法 收集3个NTDs家系,共12例研究对象纳入本研究,以NTDs患者作为病例组,家系中表型正常的成员为对照组.抽取12例研究对象的外周血,提取基因组DNA.使用重亚硫酸盐处理基因组DNA,全基因组扩增方式扩增片段化,置Illumina Infinium人类甲基化450k芯片上,进行杂交、洗脱、延伸、成像,使用iScan软件扫描芯片,Genome Studio读取扫描图像结果.使用Illumina甲基化分析器软件进行数据分析.结果 基因差异甲基化分析显示:差异性甲基化基因位点仅占检出CpG位点的0.2％,617个差异性DNA高甲基化的位点(P＜0.05),其中63个DNA甲基化位点P＜1×10-4,包括E盒结合锌指蛋白2基因、5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶1基因等;l04个差异性DNA低甲基化的位点(P＜0.05),其中65个DNA甲基化位点P＜0.01,包括同源异型盒B7基因、runt相关的转录因子3基因等.聚类分析显示:NTDs患儿呈DNA高甲基化改变的趋势较一致,而对照组呈DNA低甲基化改变的趋势较一致.结论 在NTDs家系中,DNA甲基化异常可能是NTDs发生的危险因素之一.