Xanthocillin 具有显著的抗菌活性,结构中含有独特的异腈基.本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)MT-40 基因组的测序分析,利用本地 BLAST 等生物信息学分析工具挖掘具有合成 xanthocillin 类似物潜力的基因簇,结合米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1 异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定.结果成功从内生真菌P.chrysogenum MT-40 中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for),for基因簇中的关键生物合成基因 forB 编码的异腈基合成酶可以催化合成 2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid,基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid 的二聚化生成 xanthocillin 类似物 N,N'-(1,4-bis(4-hydroxyphenyl)buta-1,3-diene-2,3-diyl)diformamide.本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考.

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS).同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率.本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L.该工艺可大幅降低PAPS的制备成本.

目的 研究3株从紫苏中分离得到的内生真菌次生代谢产物抗肿瘤活性.方法 取处于指数生长期的5种人肿瘤细胞(人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺腺癌细胞株NCI-H1975、人结肠癌细胞株HT-29、人前列腺癌细胞株DU-145),将细胞分为实验组[内生真菌发酵产物乙酸乙酯萃取部分,菌株暹罗刺盘孢菌(ZC-J4)和产黄青霉(BP-Y6)产物给药浓度为25、50、100、300和400μg·mL-1,菌株嗜线虫镰刀菌(ZP-G1)产物给药浓度为1.56、3.13、6.25、12.5、25和50 μg·mL-1)]、阴性对照组、阳性对照组(阳性药物阿霉素,给药浓度为 0.06、0.13、0.25、0.50 和 1.00 μg·mL-1).处理 48 h 后,用噻唑蓝法(MTT)法测定肿瘤细胞的增殖状况,计算内生真菌代谢产物对肿瘤细胞生长的抑制率和半数抑制浓度(IC50);并通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)分析代谢产物中的主要成分.结果 3株紫苏内生真菌发酵产物对肿瘤细胞的增殖有抑制效果,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性;不同菌株代谢产物抑制作用差异较大,ZP-G1的次生代谢产物表现出的抑制作用最强,尤其是对 HepG2 细胞和 HT-29 细胞,IC50值分别为(6.28±0.09)和(9.03±1.05)μg·mL-1;BP-Y6和ZC-J4的次生代谢产物对肿瘤细胞的毒性较弱,对NCI-H1975的IC50值均大于400 μg·mL-1.LC-MS结果分析表明,3种内生真菌的代谢产物含有部分相同成分,真菌ZP-G1中含有香紫苏二醇、杨梅素等成分,在其余2株真菌中未发现.结论 紫苏内生真菌的部分菌株具有抗肿瘤活性,菌株ZP-G1对肿瘤细胞增殖的抑制效果较好,具有进一步开发抗肿瘤天然活性成分的潜力.

为开发天然绿色的食用菌专用型保鲜剂,对4种植物精油抑制黑曲霉(Aspergillus niger)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、绿色木霉(Trichoderma viride)和木霉(Trichoderma sp.)等病原真菌的效果进行分析,并以金针菇为材料进行初步保鲜效果评价.研究结果显示,薰衣草精油对黑曲霉的抑制率最高,为17.86％,柠檬醛对产黄青霉及木霉的抑制率最高,分别为16.69％和34.41％,而茴香油则对绿色木霉的抑制率最高,达17.39％.经柠檬醛处理的金针菇在保鲜过程中,失重率、褐变度被显著抑制,还原糖含量增加,CAT活性降低的趋势被减缓.这些指标均显示柠檬醛具有较好的保鲜效果,是开发天然绿色保鲜剂的良好材料.

目的 阐明产黄青霉S-3-25的硫酸二乙酯(DES)诱变突变株3d10-01的次级代谢产物及其抗肿瘤活性.方法 利用各种色谱技术分离纯化代谢产物.根据理化和波谱数据鉴定化合物结构.采用MTT法测试其抗肿瘤活性.采用HPLC-UV检测方式确定所得化合物是否为突变株新产.结果 从突变株发酵产物中分离鉴定了2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸甲酯(1),6-羟甲基-2,2-二甲基-苯并二氢吡喃-4-酮(2),regiolone(3),(3S,4S)-3,4-二氢-3,4,8-三羟基-2H-萘酮(4),脑苷脂C(5),脑苷脂D(6)和dankasterone A(7)7个化合物.化合物1、4和7对受试5种癌细胞均有较强抑制作用;2、3和6对受试HL-60细胞有一定抑制活性.HPLC-UV的检测结果表明,化合物1～4和7为原始菌不产而突变株新产的次级代谢产物.结论 化合物1～7均为首次从产黄青霉发酵产物中分离得到.化合物1～4、6和7对部分受试肿瘤细胞的抑制活性为首次研究并报道.

海洋真菌能够产生大量活性独特的次级代谢产物.为了探明海绵共生真菌产黄青霉LS16发酵液中抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的活性物质,本实验对副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的抑菌活性进行跟踪,采用VLC (vacuum liquid chromatography)、Sephadex LH-20柱层析、薄层层析和高效液相色谱等技术,从海绵共生真菌LS16乙酸乙酯发酵液中分离纯化得到5个化合物.进一步实验证明,化合物2具有抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus活性.根据该化合物的波谱数据(1H NMR、13C NMR)对其化学结构进行鉴定,确定其分子式为C15H15NO3,为生物碱类化合物.

目的 研究蛇足石杉内生真菌Penicillium chrysogenum MT-12经固体发酵培养后的代谢产物.方法 利用硅胶、Sephadex LH-20及半制备液相色谱等方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质及IR、MS、NMR等光谱数据鉴定化合物的结构;利用体外模型进行抗炎、乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选.结果 从P.chrysogenum MT-12固体发酵培养后的代谢产物中共分离鉴定8个二苯醚类化合物,分别为黄青霉内酯A(1)、黄青霉内酯B(2)、talaromyoneA(3)、isopenicillide (4)、penicillide (5)、hydroxypenicillide (6)、purpactinA(7)、黄青霉内酯C(8).结论 化合物1、2为新化合物,化合物3为首次从青霉属中分离得到,化合物4～8为首次从产黄青霉菌中分离得到;化合物1、2对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生有一定抑制活性,半数抑制浓度(IC50)值分别为(72.6±2.3)、(41.2±1.4) μmol/L,而所有化合物在100 μmol/L时对乙酰胆碱酯酶不显示抑制活性.

目的 鉴定犬真菌微生物群(真菌区系),并进行药敏分析,为犬致病性真菌防控提供科学依据.方法 在中国的北京地区,共有55只没有疾病史的犬被取样.用真菌培养、PCR,基因克隆和测序技术,进行犬的真菌检测和鉴定.对所有真菌分离株进行药敏分析.结果 分离获得29株真菌,形态和分子鉴定确证这些真菌为黄曲霉、杂色曲霉、日本曲霉、卷枝毛霉、总状毛霉、多变根毛霉、壳青霉、产黄青霉、厚皮马拉塞霉菌、球毛壳霉、黄色蠕形霉、多喙茎点霉、尖孢镰刀菌、枝状枝孢菌、尖孢枝孢、极细枝孢霉、类星形毛孢子菌、阿萨希毛孢子菌、光滑念珠菌、库德里阿兹威毕赤酵母和东方伊萨酵母.结果表明,犬真菌种类比较丰富,获得真菌12属21种,曲霉属、毛霉属和枝孢菌属真菌在这些致病真菌中占主导地位.药敏分析结果显示:这些真菌对制霉菌素、咪康唑、沃尔康唑、特比萘芬和氟胞嘧啶等已经产生了耐药性.结论 联合使用真菌培养、PCR,基因克隆和测序技术能有效分析犬真菌.犬的真菌大多为人兽共患病病原体.研究结果为我国犬真菌监测提供参考数据,为致病性真菌的侵袭防制提供有效工具.

目的:了解猴真菌携带情况,为猴致病性真菌感染防控提供科学依据.方法:用真菌培养、TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR、普通PCR、基因克隆和测序技术,进行猴的真菌监测分析.对所有真菌分离株进行抗真菌药敏试验.结果:从全国几个不同厂家122只猴中分离获得71株真菌,形态和分子鉴定确证这些真菌为阿萨希毛孢子菌、圆形毛孢子菌、白色念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、焦曲霉、杂色曲霉、聚多曲霉、匿名曲霉、产黄青霉、草酸青霉、变幻青霉、宛氏拟青霉、小刺青霉、绳状青霉、卷枝毛霉、多变根毛霉、伞枝犁头霉、球毛壳霉、热带头梗霉、节菱孢霉菌、暗孢节菱孢菌、链格孢、松色二孢菌.结果表明,猴真菌种类比较丰富,获得真菌11属25种,毛孢子菌属、曲霉属、青霉属、毛霉属、念珠菌属真菌在这些致病真菌中占主导地位.抗真菌药敏试验分析结果显示:这些真菌分离株对制霉菌素、两性霉素B、氟康唑、咪康唑、酮康唑、氟胞嘧啶、特比萘芬已产生了耐药性.结论:联合使用真菌培养、TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR、普通PCR、基因克隆和测序技术能有效分析猴真菌.猴的真菌大多为人兽共患病病原体.研究结果为我国猴真菌监测提供参考数据,为致病性真菌的侵袭防治提供科学依据.

目的 评价荧光染色在快速诊断真菌性鼻-鼻窦炎中的应用效果.方法 对96例2017年7月至2018年4月首都医科大学附属北京同仁医院临床诊断为真菌性鼻-鼻窦炎的患者术中留取少量真菌团块组织,拉片制成薄层涂片,滴适量荧光染料,加盖玻片,室温放置5 min,在荧光显微镜下从低倍至高倍观察真菌结构.常规进行乳酸酚棉蓝染色及1.79 mol/L KOH湿片处理,以真菌培养结果作为金标准.真菌培养阴性、镜检阳性的样本提取核酸通过ITS序列扩增,进行真菌成分的分子检测.结果 荧光染色、乳酸酚棉蓝染色、1.79 mol/L KOH湿片标本一次镜检阳性率分别为95.83％(92/96),93.75％(90/96)及91.67％(88/96),差异无统计学意义;涂片阴性标本再次涂片染色镜检,除1.79 mol/L KOH漏检2例外,荧光及乳酸酚棉蓝染色均可捕捉到真菌结构.培养阳性的65例标本,荧光着色理想,可见清晰的真菌结构,尤其对曲霉菌属与暗色真菌属菌丝区分良好,直接荧光染色拟诊与培养结果一致.有3例经乳酸酚棉蓝染色及1.79 mol/L KOH湿片观察到特征性顶囊结构及分生孢子判断为烟曲霉及链格孢属,结果与培养一致,而荧光染色此类结构着色不清.31例镜检阳性、培养阴性的样本分子检测结果显示,黄曲霉9例、烟曲霉3例、杂色曲霉1例、产黄青霉1例、链格孢霉属2例、尖端赛多孢1例、近平滑假丝酵母菌1例,13例样本为阴性结果.结论 荧光染色法可用于鼻窦真菌的快速拟诊,但在观察真菌特征性产孢及产色素结构上,与常规方法相比并无显著优势.