目的:制备特异性抗镰刀菌鸡卵黄抗体(IgY)并检测其对温度和pH的耐受性及抗真菌作用。方法:取22周龄莱杭母鸡18只，采用随机数表法将其随机分为阴性对照组和实验组，每组9只。制备灭活镰刀菌丝悬液，将菌丝浓度2×10 7菌落形成单位(CFU)/ml的菌悬液与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化后，对实验组莱杭母鸡进行免疫，每只鸡注射1 ml，2周后换为弗氏不完全佐剂加强免疫。在免疫后的第5~16周每周收集卵黄，用硫酸铵盐析法制备IgY，将得到的蛋白溶液放入冻干机中制作成冻干粉，4 ℃保存。以质量分数0.9%氯化钠溶液代替菌悬液按照同样方式进行阴性对照组莱杭母鸡的注射，以制备非特异性抗体作为实验中的阴性对照。采用考马斯亮蓝法测定特异性IgY蛋白浓度，采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其效价。将1×10 5 CFU/ml和1×10 3 CFU/ml镰刀菌悬液与不同浓度IgY及磷酸盐缓冲液(PBS)混合培养4 d后测定吸光度( A)值，用PBS及非特异性IgY与镰刀菌悬液共孵育作为空白对照组及阴性IgY组，绘制抗镰刀菌IgY的抑菌曲线。用pH 7.4的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，分别在30、40、50、60、70、80和90 ℃水浴中孵育30 min后冷却至室温；此外，用pH值为l、2、3、4、5、6、7、8、9、l0、11和12的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，4 ℃下放置1 h，均采用间接ELISA法测定抗体活性，评估IgY对不同温度和pH的耐受性。取SPF级8周龄雌性C57BL/6小鼠12只，采用随机数表法将其分为PBS对照组和特异性IgY治疗组，每组6只。用镰刀菌感染小鼠右眼角膜，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，建模后1 d，特异性IgY治疗组用200 mg/ml特异性抗镰刀菌IgY点眼，PBS对照组用PBS点眼，于感染后1、3和5 d在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜，根据炎症评分表对真菌性角膜炎的严重程度进行评分。 结果:免疫后第5~16周的IgY蛋白质量浓度分别为1.57、2.89、24.98、25.09、23.89、25.78、21.57、21.37、18.98、15.78、14.67和12.67 mg/ml。特异性抗镰刀菌IgY的效价从第5周开始升高，第7周时达到最高效价，为1∶10 000，可维持至免疫后12周，12周后抗体效价逐渐下降。抑菌曲线显示，与空白对照组和阴性IgY组相比，特异性IgY治疗组镰刀菌生长缓慢。抗体效价高于1∶10 000的特异性IgY在60 ℃以下具有较好的热稳定性；在pH 4~6具有最高活性，在pH 3~9的免疫活性能够保持在70%以上，随着pH值的进一步降低或升高，其活性迅速降低。镰刀菌感染后1、3和5 d，PBS对照组角膜炎症评分分别为3.50±0.55、7.33±0.82和4.00±0.63，特异性IgY治疗组角膜炎症评分分别为3.33±0.82、4.17±0.75和2.50±0.55。2个组不同时间点炎症评分总体比较，差异均有统计学意义( F分组＝247.35， P<0.05； F时间＝23.19， P<0.05)，其中镰刀菌感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组小鼠真菌性角膜炎炎症评分降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:用硫酸铵盐析法可成功制备高效价特异性抗镰刀菌IgY，其稳定性高，对温度和酸碱度均有一定的耐受性，可以在小鼠的真菌性角膜炎模型中减轻角膜溃疡的严重程度，降低炎症评分。

目的:探究改良St. Thomas灌注液预灌注对犬骨骼肌缺血再灌注损伤（IRI）的保护作用及机制。方法:2021年3月-2021年9月，在解放军东部战区空军医院实验手术室，将16只比格犬通过随机数字表法分为对照组、IRI组、IRI加生理盐水（IRI+NS）组和改良St. Thomas组，每组4只,构建犬骨骼肌IRI模型，通过预灌注改良St. Thomas灌注液[氯化钾（KCl）、硫酸镁（MgSO 4）以及NaHCO 3（pH调整）]，监测犬生命体征，通过苏木素-伊红（HE）染色、电镜检测和组织湿/干重比探究犬骨骼肌病理损伤，通过标记血管和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）检测其血管密度和乏氧表现。构建L6鼠成肌细胞IRI模型，预孵育St. Thomas灌注液各组分，探究对细胞增殖抑制的影响，并通过检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、F2异前列腺素（F2-isoprostane）、白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、髓过氧化物酶（MPO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等探究其保护机制。采用统计软件SPSS 23.0进行统计学处理， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:改良St. Thomas组犬生命体征较稳定，多巴胺维持量少，腓肠肌组织病理结构趋于完整，组织细胞及线粒体肿胀明显缓解，组织湿/干重比小于IRI组（ P=0.046）。预孵育治疗剂量的MgSO 4或NaHCO 3，细胞增殖率大于IRI组（ P<0.01、 P=0.005），NADPH（ P=0.004、 P=0.01）、F2-isoprostane（ P<0.001、 P=0.01）、IL-1β（ P=0.02、 P=0.015）、TNF-α（ P<0.01、 P<0.01）、MPO（ P<0.01、 P<0.01）均较IRI组下降，GSH-Px较IRI组升高（ P<0.01、 P<0.001）。 结论:预灌注改良St. Thomas灌注液，可在短期内使犬生命体征趋于平稳，灌注液可能通过抗炎、抗氧化应激，改善骨骼肌细胞状态，改善组织缺氧，减轻骨骼肌组织细胞损伤。

为明晰生淀粉水解α-淀粉酶Amy486 独特的催化特征,将克隆自Exiguobacterium sp.J84 菌株的amy486 进行重组表达,并研究重组酶的酶学性质、嗜盐特性和钙离子依赖性.Amy486 最适催化pH为7.5,在pH 6.5～8.5 范围内酶活力保持 40%以上,最适温度为35℃,30℃半衰期为100 h.1.5 mol/L Na2 SO4 处理可将Amy486 的比酶活由 1.53 U/mg提升至 2209 U/mg.添加 1.0 mol/L Na2 SO4,Amy486 在 35℃放置 500 h,酶活力可保持 60%以上.2.5 mmol/L CaCl2 可提升酶活力至 110%,添加超过 5 mmol/L CaCl2,Amy486 的相对酶活力降至 100%以下,EDTA孵育对Amy486 蛋白的酶活力和稳定性影响较小.Amy486 与钙离子结合的关键位点为K302,K302E与钙离子的结合能力增强,从而降低该酶对外源钙离子的依赖性.α-淀粉酶Amy486 及其突变体酶K302E是具有较高比酶活的生淀粉水解酶,对外源钙离子的依赖性较低,其活力的发挥依赖于适合的盐浓度,可应用于某些高盐环境下的淀粉水解.

目的 对静注人免疫球蛋白(intravenous human immunoglobulin,IVIG)新生产工艺的病毒灭活/去除效果进行验证及评估.方法 选择4种脂包膜病毒[人免疫缺陷综合征病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)]及非脂包膜病毒[猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)]作为验证病毒,在缩小的生产规模条件下考察辛酸钠沉淀/深层过滤、低pH孵放和纳米膜过滤步骤对一种或几种指示病毒的灭活/去除能力.结果 辛酸钠沉淀/深层过滤步骤可灭活/去除PPV 1.88 Log;低pH孵放对HIV、PRV、SV和VSV的灭活效果最低分别为≥5.22、≥4.26、≥6.56和≥5.69 Log;Bio EX纳米膜可去除PPV达4 Log以上.结论 IVIG新生产工艺的病毒灭活/去除效果合格,可有效灭活/去除未知的、新出现的病原体.

目的 建立人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor or Cl inhibitor,C1-INH)活性的动态显色检测方法,并进行验证.方法 采用棋盘法分析C1酯酶与发色底物C1E 5603[CH30C-Lys(Cbo)-Gly-Arg-pNA· AcOH]反应后的A值变化率(△A/min),确定能使不同浓度酶饱和的最低底物浓度.将C1-INH浓缩制剂标准品与C1酯酶孵育,剩余的C1酯酶与底物C1E 5603作用产生A值,将△A/min与C1-INH活性进行拟合,绘制标准曲线.验证该方法的线性范围、选择性、特异性、准确度、精密度、稳定性,并进行样品添加试验.将验证后的该方法应用于C1-INH制备工艺过程样品的分析.结果 确定C1酯酶的浓度为28 μg/mL,底物浓度为2.4 mmol/L,反应结果监测4 min.C1-INH标准品在0.15～0.025 IU/mL范围内与△A/min呈良好的线性关系,R2≥0.99,校正标样回算浓度在标示值的90.2％～105.4％内;CM阳离子交换层析洗脱缓冲液、HIC疏水层析平衡缓冲液、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)、人纤溶酶(plasmin,Plm)的响应值均低于定量下限响应的7.2％,并低于内标响应的2.7％;20 mmol/L以下的pH5.0NaAc及300 mmol/L以下的NaCl对C1-INH活性检测无影响;检测定量上限、高、中、低、定量下限质控样品,批内准确度在90.0％～114.8％之间,批内CV在0.7％～ 13.7％之间,批间准确度在94.2％～108.3％之间,批间CV在1.2％～9.7％之间;C1酯酶与底物C1E 5603室温放置3h不影响检测结果;样品添加试验回收率在94.5％～ 106.1％之间.CM阳离子交换层析洗脱液、DEAE阴离子交换层析洗脱液、HIC疏水层析流穿液中C1酯酶抑制剂的特异性活性逐渐升高,分别为0.79、1.84、2.61 IU/g.结论 本方法具有良好的选择性、准确度、精密度、特异性及稳定性,可作为C1-INH制备工艺中的内部控制指标.

目的 评估本公司静注人免疫球蛋白(IVIG)的生产工艺对活化凝血因子Ⅺ(FⅪa)的去除能力,以期确保产品的安全性.方法采用基团显色法,对9个投浆批次制品低温乙醇血浆蛋白分离纯化阶段,和对应3个批次制品组分Ⅱ(FⅡ)沉淀合并精制,以及制剂阶段的各工艺步骤中,在制品的FⅪa含量进行了研究.结果低温乙醇分离工艺过程中,FⅠ+Ⅲ过滤步骤将FⅪa含量由(8.1±1.3)mU/mL(FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀溶解液),降到低于2.0mU/mL的检测下限(FⅠ+Ⅲ上清液);制剂阶段中低pH 孵放步骤,则将原液和半成品的FⅪa含量由(15.4±1.7)mU/mL(原液超滤配制前),分别降至(2.9±0.9)mU/mL 和(2.8±0.6)mU/mL.结论本公司IVIG 制品中FⅪa含量较低,现有的生产工艺可以有效确保FⅪa的去除,从而进一步降低了IVIG 潜在的致血栓风险.

背景:利用缓释技术将成血管基因转染至细胞是组织工程骨充分血管化的关键,而选择安全有效的基因载体至关重要.目的:制备超顺磁性壳聚糖纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIOCN)与超顺磁场壳聚糖质粒明胶微球(superparamagnetic chitosan plasmid gelatin microspheres,SPCPGM),并对其进行表征.方法:利用脱水缩合反应制备SPIOCN,对其分子结构、形态和粒径、饱和磁化强度、ζ电位及DNA结合能力进行表征.将SPIOCN溶液与成骨肉瘤细胞MG-63共孵育24 h,采用透射电镜观察细胞吞噬SPIOCN的过程.制备SPCPGM与非磁性壳聚糖明胶微球,将其填入人工多孔骨植入体中,在37℃的PBS(pH=7.4)中进行体外药物溶出实验,采用振荡磁场干预,测定质粒释放量.取成骨肉瘤细胞MG-63及人脐静脉内皮细胞HUVEC-1,分4组转染,PolyMag200(商业化磁转染试剂)/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pDNA质粒组(对照组),转染24 h后,利用倒置荧光显微镜与流式细胞仪检测转染效果.将人脐静脉内皮细胞HUVEC-1分4组培养,PolyMag200/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pDNA质粒组(对照组),培养24,48,72 h后检测细胞存活率.结果与结论:①SPIOCN的平均粒径为(187±24)nm,饱和磁化强度为(20.3±4.5)emu/g,ζ电位为(9.5±2.4)mV,具有结合保护质粒DNA转染MG-63细胞及HUVEC-1细胞的能力;②SPIOCN贴附细胞膜后,通过胞膜内吞作用进入细胞,细胞浆内可见散布吞噬SPIOCN的内涵体;③在磁场干预下,SPCPGM多孔骨植入体的质粒释放量明显高于非磁性壳聚糖明胶微球多孔骨植入体(P<0.05);④转染MG-63或HUVEC-1细胞后,PolyMag200/pDNA+静磁场组转染效率高于其余3组(P<0.05),SPIOCN/pDNA+静磁场组高于SPIOCN/pDNA组及对照组(P<0.05);⑤与对照组比较,SPIOCN/pDNA+静磁场组、PolyMag200/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率降低(P<0.05),而SPIOCN/pDNA组细胞存活率无明显变化;SPIOCN/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率高于PolyMag200/pDNA+静磁场组(P<0.05);⑥结果表明,SPIOCN具有粒径小、分散性好、毒性低、超顺磁性及结合保护DNA转染细胞的特点,振荡磁场联合SPCPGM是一种较理想的缓释基因载体系统.

目的 化疗在结直肠癌的治疗中有着不可替代的地位,但传统化疗药物由于诸多缺陷难以达到令人满意的疗效,本研究制备了在液体中具有pH响应性的载表柔比星(epirubicin,EPI)的聚氨基酸纳米粒子(nanoparticle/epirubicin,NP/EPI),研究其在结直肠癌化疗中疗效及安全性.方法 以聚乙二醇-block-聚谷氨酸〔methoxy poly(ethylene glycol)-block-poly(L-glutamic acid),mPEG-b-PGA〕为载体,以EPI为模型抗肿瘤药,合成NP/EPI.应用透射电子显微镜及动态激光光散射对NP/EPI进行表征.通过体外药物释放及粒径稳定性实验检测NP/EPI的pH响应性.应用CCK8法检测mPEG-b-PGA细胞相容性及药物细胞毒性.选取C26细胞构建小鼠结直肠癌皮下荷瘤模型,待肿瘤长至约100 mm3时,随机分为EPI组、NP/EPI组及对照组,每组10只.通过小鼠肿瘤体积变化、肿瘤组织病理学检测和原位凋亡染色评估NP/EPI疗效,通过小鼠体质量及生存率变化评估NP/EPI安全性.结果 NP/EPI呈粒径(93.71±7.37)nm的规则球形.NP/EPI在pH7.4、pH6.8及和pH 5.3中的36 h药物累积释放率分别为(35.54±2.13)％、(62.79±2.34)％和(80.12±2.96)％,3组差异有统计学意义,F=241.324,P<0.001.NP/EPI的粒径随着pH值降低逐步增加,在pH7.4、6.8及5.3的环境中孵育24 h后NP/EPI的粒径分别为(102.48±9.85)、(258.48±20.70)和(327.56±27.87)nm,差异有统计学意义,F=153.177,P<0.001.mPEG-b-PGA具有良好的细胞相容性,高浓度梯度的mPEG-b-PGA处理48 h,C26细胞仍保持了90％ 以上的活性.NP/EPI对C26细胞的24 h IC50值为(2.97±0.71)μg/mL,高于EPI的(1.52±0.27)μg/mL,差异有统计学意义,t=3.335,P=0.029,但两者48 h IC50比较〔(0.41±0.05)vs(0.31±0.07)μg/mL〕,差异无统计学意义,t=2.049,P=0.110.体内实验证实,NP/EPI增强了EPI治疗结直肠癌疗效,治疗结束时对照组、EPI组及NP/EPI组肿瘤体积分别为(2846.72±305.28)、(1038.72±121.36)及(627.18±107.54)mm3,3组差异有统计学意义,F=202.370,P<0.001.NP/EPI组的肿瘤抑制率为(90.10±1.16)％,高于EPI组的(79.58±2.03)％,差异有统计学意义,t=10.674,P<0.001.HE及Tunel染色结果证实,共聚物保护能够明显增强EPI引起的肿瘤组织坏死及细胞凋亡.在生物安全性方面,对照组、NP/EPI组及EPI组治疗结束时小鼠体质量分别为(26.99±1.84)、(22.08±1.76)和(18.02±1.84)g,3组差异有统计学意义,F=33.777,P<0.001,且NP/EPI组小鼠生存率为70％,高于EPI组的30％.结论 以 mPEG-b-PGA 为基础的纳米粒子具有良好的 pH 响应性,能够优化 EPI 的结直肠癌疗效及安全性,具有良好的医学应用前景.

目的:制备雷公藤红素长循环脂质体,筛选合适的冻干保护剂,并对其体外性质进行初步研究.方法:采用薄膜分散法制备雷公藤红素长循环脂质体,以粒径和包封率为考察指标,优化制备处方并筛选合适的冻干保护剂;采用透析法考察体外释放行为;HPLC法测定HepG2细胞的雷公藤红素细胞摄取量;MTT法评价细胞毒性.结果:最优处方为超声强度15％ (10 min);磷脂与胆固醇质量比10∶1;药物与脂质质量比1:30;DSPE-PEG摩尔百分比5.4％.制得雷公藤红素长循环脂质体粒径为(143.2土2.4)nm,包封率为(97.3±1.4)％,形态较均一且在4℃可稳定放置20 d.蔗糖相比于海藻糖和甘露醇具有更好的冻干保护作用,其与总脂质量比为1∶1时,冻干复溶后雷公藤红素的包封率在90％以上.在37℃、pH 7.4的释放介质中,雷公藤红素长循环脂质体36 h的累积释放率只有30％左右,约为游离雷公藤红素组的一半;与HepG2细胞孵育4h后,雷公藤红素长循环脂质体组的细胞摄取量为34.5 ng· μg-1,是游离组的5.3倍;与HepG2细胞孵育24 h后,测得雷公藤红素长循环脂质体IC50值为0.83 μg·mL-1,降低到游离组的1/3.结论:本研究成功制备了一种稳定、形态均一、分散较好、包封率高的长循环雷公藤红素脂质体,该脂质体在体外可以延缓药物释放,提高细胞摄取量,增强细胞毒性.

目的 比较两种低pH孵放法对静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins,ⅣIG)中脂包膜病毒的灭活效果.方法 IVIG中分别加入两种核酸类型的脂包膜病毒水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)及伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,以经典工艺(23 ～ 25℃灭活21 d)及新工艺[(37±0.5)℃灭活9h]低pH(pH为3.8～4.4)孵放法进行病毒灭活,分别检测不同灭活时间的病毒滴度,比较灭活效果.结果 经典工艺低pH孵放法对VSV灭活效果≥5.88 logTCID50/0.1 mL,对PRV的灭活效果≥6.00 logTCID50/0.1 mL,且灭活的样品在敏感细胞盲传3代无细胞病变.新工艺低pH孵放法对VSV灭活效果≥4.62 logTCID50/0.1 mL,对PRV的灭活效果≥6.12 logTCID50/0.1 mL.结论 两种低pH孵放法对指示病毒的灭活能力均符合国家标准,但经典工艺对两种指示病毒的灭活效果好且灭活彻底.