目的:本研究旨在制备生物合成纳米载体递送柚皮素(naringenin,Ng),并研究其对乳腺癌的体外抑瘤效果.方法:使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-前列腺素F2受体阴性调节因子-绿色荧光蛋白(Arg-Gly-Asp-prostaglandin F2 receptor negative regulator-green fluorescent protein,RGD-P-G)质粒进行转染,构建分泌 RGD-P-G 外泌体(RGD-P-G-Exosomes,RGD-P-G-Exo)的293F细胞.通过超速离心收集293F细胞上清液中的RGD-P-G-Exo,加入Ng,并通过水浴超声促使RGD-P-G-Exo包封Ng,形成RGD-P-G-Exo@Ng.使用荧光显微镜对转染RGD-P-G的293F细胞进行鉴定.通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术、蛋白质免疫印迹等方法对RGD-P-G-Exo@Ng的形貌、粒径、标志物和绿色荧光蛋白(GFP)表达情况进行表征.采用紫外分光光度法评估包封率和载药量.通过细胞摄取实验评估纳米药物被吞噬摄取的效果.通过CCK-8法检测Exo@Ng和RGD-P-G-Exo@Ng对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤能力.结果:电镜结果显示RGD-P-G-Exo@Ng呈茶托状结构,纳米颗粒追踪分析技术显示RGD-P-G-Exo@Ng粒径主要分布在147.0 nm.蛋白免疫印迹结果表明RGD-P-G-Exo@Ng表达CD9、CD63等外泌体标志物和GFP,证明RGD-P-G-Exo的构建成功.RGD-P-G-Exo@Ng纳米药物的包封率为(28.1±0.6)％,载药量为(6.0±0.1)％.在高浓度下,Exo及RGD-P-G-Exo对MDA-MB-231细胞的存活率无显著影响,具有良好的生物相容性.在细胞摄取实验中,与Exo@Ng相比,RGD-P-G-Exo@Ng具有更强的细胞摄取效果(P＜0.05).药效实验中,Exo@Ng和RGD-P-G-Exo@Ng均表现出浓度依赖性的MDA-MB-231细胞毒性,其中RGD-P-G-Exo@Ng比相同浓度的Exo@Ng具有更强的细胞杀伤能力(P＜0.05).结论:本研究初步合成了一种用于靶向递送Ng的纳米药物,为开发生物纳米靶向肿瘤药物递送系统提供了新的策略.

目的 合成透明质酸-甘氨酸-喜树碱聚合物胶束(HA-Gly-CPT胶束),并且评价该胶束的质量,初步研究其体外抗肿瘤活性.方法 利用甘氨酸将透明质酸与喜树碱连接,形成两亲性聚合物;通过红外光谱法、核磁共振氢谱法表征其结构;直接溶解法制备HA-Gly-CPT胶束,马尔文激光粒度仪测定胶束粒径、Zeta电位,并考察胶束的稳定性;透射电镜观察胶束的外观;透析法研究其pH响应性体外释放;MTT法检测其抗肿瘤活性.结果 红外光谱、核磁共振氢谱结果确定两亲性聚合物成功合成;HA-Gly-CPT胶束呈球形,平均粒径为(279.86±4.15)nm,Zeta 电位为(-20.17±0.52)mV,在酸性介质中(pH 5.0),HA-Gly-CPT在48 h喜树碱释放度达到50％.MTT实验结果表明HA-Gly-CPT胶束对正常细胞L929生长无影响,而50μg·mL-1 HA-Gly-CPT胶束对肿瘤细胞MCF-7生长抑制率高于80％.结论 成功合成了两亲性聚合物,并制备质量良好且具有pH响应的HA-Gly-CPT胶束.体外实验证明HA-Gly-CPT胶束具有明显的抗肿瘤活性.

目的 制备一种针尖层负载透明质酸(Hyaluronic acid,HA)修饰的盐酸青藤碱脂质体可溶性微针(HA-SMH-Lip-DMNs),对其进行表征,并考察其体外透皮性能、细胞摄取能力和体外抗炎能力.方法 采用两步浇铸法制备HA-SMH-Lip-DMNs,使用高效液相色谱(HPLC)法测定其载药量,通过扫描电镜、穿刺试验、Franz扩散池法等检测其形态、皮肤穿刺性能和体外透皮能力.以异硫氰酸荧光素脂质体(HA-FITC-Lip/FITC-Lip)代替HA-SMH-Lip,制备荧光微针(HA-FITC-Lip-DMNs/FITC-Lip-DMNs),并运用流式细胞仪和荧光显微镜观察炎症细胞对HA-FITC-Lip-DMNs/FITC-Lip-DMNs的摄取情况.利用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中的炎症因子一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素 1β(IL-1β)和白细胞介素 10(IL-10)水平,评估HA-SMH-Lip-DMNs的抗炎作用.结果 制备的HA-SMH-Lip-DMNs形状大小均匀,阵列完整美观,每片平均载药量(114.01±1.04)μg,有良好的穿刺能力.体外透皮结果显示HA-SMH-Lip-DMNs 36 h的累积释放量为(101.47±2.91)μg·cm-2,其透皮能力优于 SMH 溶液组.体外摄取结果表明 RAW 264.7 细胞对HA-FITC-Lip-DMNs摄取较多(P＜0.01).与模型组相比,HA-SMH-Lip-DMNs组能显著降低TNF-α、IL-1β和NO的水平(P＜0.01),同时提高IL-10 的水平(P＜0.01).结论 该研究制备的HA-SMH-Lip-DMNs具备良好的形态特征、细胞摄取能力、体外透皮性能以及抗炎活性,有望成为一种新型的经皮给药系统.

目的:构建患者来源腮腺多形性腺瘤（PA）类器官模型，并对其组织学、相关标志物和功能进行初步表征。方法:收集大连大学附属中山医院口腔颌面外科术中取材新鲜肿瘤组织标本，采用头颈部肿瘤类器官培养体系进行体外培养，构建腮腺PA类器官。观察PA类器官的体外生长情况并进行光镜拍摄。对培养成功的类器官进行传代和冻存，并对冻存的PA类器官进行复苏再培养，观测其活性和PA类器官再形成能力。对比患者来源组织，对PA类器官进行组织学表征，相关标志和功能蛋白进行表征与检测，评价PA类器官对来源组织的复现性。结果:构建的腮腺PA类器官形成紧实致密球状结构，HE染色提示类器官与其来源组织形态相似，免疫组化可见类器官及其来源肿瘤组织钙调蛋白、细胞角蛋白7、上皮膜抗原胞质阳性，提示类器官与其来源组织的病理学特征一致；PA类器官过碘酸希夫（PAS）染色及淀粉酶消化后PAS染色呈阳性，阳性着色位于类器官球体内部及外周，提示PA类器官具有类似于腮腺的分泌功能。结论:成功构建患者来源PA类器官，该模型在组织形态和标志物上可高度复现来源组织情况，并具有黏液分泌的生物学功能，是研究腮腺肿物发生发展的良好体外模型。

目的:对天然猪小肠黏膜下层(SIS)膜进行表面修饰以提升其生物学活性。方法:采用溶胶-凝胶法对天然SIS膜进行了纳米羟基磷灰石(nHA)表面涂层以获得新型SIS/nHA膜，将0.5 mol/L四水硝酸钙[Ca(NO 3) 2·4H 2O]溶于无菌去离子水并搅拌均匀，随后将0.5 g SIS膜基材浸没其中持续搅拌20 min，加入0.3 mol/L磷酸氢二铵[(NH 4) 2·HPO 4]溶液，并滴加氢氧化铵(NH 4OH)调节溶液pH至10，37 ℃下磁力持续搅拌直至溶胶形成，待反应完全后，取出SIS基材，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，室温干燥。重复上述溶胶-凝胶过程3次，获得SIS/nHA膜。然后利用能谱-扫描电镜对材料表面理化性质进行表征，再将小鼠前成骨细胞以5×10 4细胞/膜的密度接种于各组材料，通过死活染色和噻唑蓝(MTT)试剂盒检测细胞在1、3、7 d增殖活性，同时将人脐静脉内皮细胞悬液(100 μl，1×10 5/ml)接种于铺有Matrigel胶的96孔板，比较SIS/nHA和SIS诱导成管能力。组间比较采用独立样本 t检验。 结果:溶胶-凝胶法成功将nHA沉积于SIS膜表面，与单纯的天然SIS膜比较，修饰后的SIS/nHA具有更理想的纳米磷灰石表面拓扑形貌；而且，体外实验证实培养1 d时，SIS和SIS/nHA的成骨增殖活性差异无统计学意义(0.215±0.027比0.230±0.035， t＝0.588， P>0.05)；而持续培养3 d(0.382±0.041比0.261±0.031， t＝4.077， P<0.05)和7 d(0.543±0.055比0.392±0.040， t＝3.846， P<0.05)后，SIS/nHA的成骨增殖活性显著高于SIS，差异均有统计学意义。体外成骨结果表明，SIS/nHA诱导4 h形成的成管节点数显著高于SIS组[(46.5±6.4)个比(31.3±5.1)个， t＝3.217， P<0.05]，同时SIS/nHA诱导形成的管腔长度也显著高于SIS组[(5 170.6±620.5) μm比(3 482.2±480.1) μm， t＝3.727， P<0.05]，差异均有统计学意义。 结论:nHA涂层修饰有效提升了SIS膜的表面生物活性，可在一定程度上为SIS的表面改性提供实验依据。

目的:构建一种新型阿霉素-壳聚糖乳酸盐纳米缓释载体用于骨肉瘤治疗研究。方法:2%乳酸水溶液制备水溶性的壳聚糖乳酸盐，pH 5.0的反应体系中，壳聚糖乳酸盐与TPP以10:1的投料比制备载阿霉素的壳聚糖乳酸盐纳米微粒（ChLa-Dox NPs），动态光散射（DLS）分析其粒径、多分散系数、Zeta电位，扫描电镜进行微观形貌学表征，ChLa-Dox NPs的生物学效应检测则通过缓释载体体外缓释动力学、MG63骨肉瘤细胞系细胞毒性实验、细胞迁徙能力及流式细胞术检测。结果:在pH 5.0及壳聚糖乳酸盐：TPP的投料比为10:1的反应条件下制备的ChLa-DoxNPs平均粒径为142.4±1.21 μm，多分散系数（PDI）为0.14±0.01，Zeta电位为+29.2 mV。ChLa-DoxNPs在体外10h时阿霉素达到缓释平台期，缓释12 h内阿霉素累积释放率为（69.4±2.6）%；MG63细胞系骨肉瘤细胞模型实验中，空载纳米微粒组细胞存活率为92.36±3.17%，而不同载药量的ChLa-Dox NPs组具备显著的骨肉瘤细胞杀伤作用。相比空载体组，ChLa-Dox NPs对骨肉瘤细胞迁徙能力有显著的抑制作用，明显促进骨肉瘤凋亡的发生[（凋亡率为（54.08±2.53%）]。结论:经改良制备的载阿霉素壳聚糖乳酸盐纳米微粒符合抗肿瘤纳米载体的理化特性要求，生物相容性好，体外缓释动力学及抗骨肉瘤相关分子-细胞生物学检测表明其具备较好的阿霉素缓释特性，体外能有效的抑制骨肉瘤细胞增殖、迁徙并促进其凋亡，具有较明确的临床转化前景。

目的:探讨胃癌细胞来源的外泌体与肝Kupffer细胞间的相互作用对胃癌肝转移的影响，并揭示其潜在的作用机制。方法:通过裸鼠模型、病毒转染和流式分选技术，从胃癌细胞株(MKN45)中构建具有高度肝转移潜能的细胞株(MKN45-HL)。超速离心法收集外泌体，并通过纳米流式仪、透射电镜以及Western blot等进行表征和鉴定。构建胃癌细胞外泌体训导的裸鼠肝转移模型，并经活体成像技术监测肝转移灶的发展。通过细胞培养、qRT-PCR和免疫荧光染色等分析胃癌细胞外泌体对巨噬细胞极化的作用。利用外泌体miRNA的组学分析和qRT-PCR筛选验证胃癌外泌体促巨噬细胞M2极化的miRNA分子靶点。结果:胃癌来源的外泌体主要集中在肝脏，大多数被肝内巨噬细胞所摄取，且在体外培养和裸鼠体内都能促进巨噬细胞向M2型极化。MKN45与MKN45-HL外泌体训导的裸鼠经脾脏注射小鼠前胃癌细胞后均出现明显的肝转移灶，且MKN45-HL外泌体表现出更强的促肝脏巨噬细胞M2极化和促胃癌细胞肝转移的能力。两者的miRNA组学分析显示了很多差异性表达的miRNAs。高肝转移潜力的胃癌细胞系和肝转移患者血清外泌体中miR-519a-3p显著升高，可经外泌体被巨噬细胞内化，对胃癌肝转移有预测价值，并与肝转移预后密切相关。结论:胃癌细胞来源的外泌体经miR-519a-3p触发肝Kupffer细胞的M2样极化，推进胃癌的肝转移进程，可能是塑造胃癌肝转移前生态位微环境的重要分子。本研究为揭示胃癌肝转移机制提供了新视角，并为未来的治疗策略提供了潜在靶点。

目的:考察聚多巴胺改性胶原膜复合材料对软骨组织的黏合力及对软骨细胞增殖的影响，进一步探讨其在自体软骨细胞移植中应用的可能性。方法:制备胶原膜材料，通过吸附法构建聚多巴胺改性的胶原膜复合材料。通过红外光谱仪、热重分析仪、差示热分析仪、扫描电镜和X射线光电子能谱仪等分别对复合材料的热稳定性、热学性质、多孔结构和表面元素组成等理化性质和结构特征进行表征；通过力学试验机测试聚多巴胺改性的胶原膜与新鲜软骨组织间的黏附力；通过体外细胞培养方法考察复合材料对兔软骨细胞黏附和增殖的影响。结果:复合材料结构和表面元素组成随聚多巴胺吸附时间的增加而变化，聚多巴胺吸附量随复合时间延长而增加；聚多巴胺的复合对胶原膜材料的热稳定性和热学性质无明显的影响；复合材料对软骨组织的黏附力随聚多巴胺吸附量的增加而增强；复合材料对软骨细胞具有时间相关性地促进作用。结论:聚多巴胺改性胶原膜复合材料在关节软骨修复中具有潜在的应用价值，但用于关节软骨修复之前，需要更多的研究来优化复合材料。

目的:对1个遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者所携带的复合杂合突变进行分子机制研究。方法:先证者因“突发晕厥并四肢抽搐一天”于2018年11月就诊于温州医科大学附属第一医院。采集先证者及其家系成员（共3代9人）外周静脉血并进行家系调查。采用发色底物法检测AT活性（AT：A），免疫比浊法检测AT抗原（AT：Ag）。对SERPINC1基因进行直接测序以确定突变位点。利用多种计算机工具预测突变的保守性和疏水性变化。构建重组质粒表达载体并瞬时转染HEK293T细胞以进行体外过表达研究。采用Western Blotting、ELISA和细胞免疫荧光实验对重组AT蛋白进行体外表征。结果:先证者为一例21岁男性。AT：A为 33%，AT：Ag同步下降，属于Ⅰ型AT缺陷症。基因分析显示先证者在第2和第5外显子分别携带c.318_319insT（p.Asn107*）杂合插入突变和c.922G>T（p.Gly308Cys）杂合错义突变。该两个突变位点在同源物种中均完全保守；疏水性分析表明，p.Gly308Cys突变可能降低氨基酸残基307-313的亲水性。体外表达显示，重组蛋白AT-G308C在转染细胞裂解液和培养上清中的含量分别降低至46.98%±2.94%和41.35%±1.48%；经蛋白酶体抑制剂（MG132）处理后，Western Blotting分析显示在细胞质中的AT-G308C蛋白量恢复到与野生型相似的水平；在细胞裂解液和培养上清中均未检测到重组蛋白AT-N107*。结论:p.Asn107*杂合插入突变和p.Gly308Cys杂合错义突变与该家系先证者AT水平降低有关。p.Asn107*杂合插入突变可能触发无义突变介导的mRNA降解，从而消除异常转录本；p.Gly308Cys杂合错义突变可能通过改变局部残基的疏水性导致AT蛋白在细胞质中发生蛋白酶体依赖性降解。

目的:构建乳腺癌类器官培养体系并对其进行组织学表征与初步放射生物学特征研究。方法:体外培养不同分子分型乳腺癌细胞系和肿瘤组织细胞形成乳腺癌类器官，对其进行组织结构表征并利用Ki-67、ER、PR、Her2指标进行免疫组化染色；对三阴性乳腺癌患者组织及乳腺癌细胞系形成的类器官进行4、8 Gy照射处理，观测照射后0、24、48、96 h的乳腺癌类器官个数以及直径变化来评估放射对类器官的杀伤情况。结果:乳腺癌细胞系和患者来源组织在6 d左右形成类器官结构；HE染色显示微结构，标志物表达具有空间异质性，肿瘤来源类器官与原组织的标志物表达具有相似性；照射处理MCF-7乳腺癌类器官后，生长停滞，部分形成的类器官崩解消失，48~96 h，逐渐恢复增殖趋势；MDA-MB-231乳腺癌类器官呈现辐射耐受和生长停滞，但结构没有明显改变，96 h仍未观察到恢复趋势；选取的三阴性患者组织来源的类器官也呈现辐射耐受，照射后类器官仍持续生长且结构没有明显改变，但生长趋势明显小于未照射组。结论:不同来源与不同分子分型的乳腺癌细胞经体外培养形成的乳腺癌类器官具有微结构与异质性，可以反映来源组织标志物表达情况并展现不同的放射抵抗能力，三阴性乳腺癌来源的类器官更加耐照射。