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紫色色杆菌转氨酶基因表达载体的构建及其原核表达
编辑人员丨2天前
目的 利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶(CV2025)基因序列构建重组质粒pET-28a-CV2025,并在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中进行原核表达.方法 将CV2025基因序列与pET-28a(+)载体连接,构建重组质粒pET-28a-CV2025,转化E.coliTOP10中进行阳性克隆子筛选,经双酶切及测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,诱导表达目的蛋白;将重组菌28a-CV2025-BL21活化后接种2TY液体培养基,IPTG诱导表达制备粗酶液后,以异丙胺为氨基供体,1-(4-甲氧苯基)乙酮、邻氟苯乙酮、苯乙酮为氨基受体,采用薄层色谱法监测反应,初步检验转氨酶活性,高效液相色谱法进行进一步分析.结果 重组质粒pET-28a-CV2025经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组菌28a-CV2025-BL21、28a-CV2025-Rosetta的表达产物均可见相对分子质量约51 000的目的蛋白条带,且28a-CV2025-BL21表达的蛋白大部分以可溶性形式存在;酶液催化后,1-(4-甲氧苯基)乙酮与异丙胺发生转氨基化反应,生成对应的手性胺1-(4-甲氧苯基)乙胺,具有一定的催化活性.结论 在E.coli中成功表达了CV2025,初步检验上清中可溶性蛋白具有酶活性,为后期转氨酶的分离、纯化以及增强产物转化率奠定了基础.
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编辑人员丨2天前
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基于转录组测序技术研究黑水虻幼虫对锌离子胁迫的响应
编辑人员丨2天前
黑水虻Hermetia illucens L.是世界范围内重要资源昆虫,过量锌离子(Zn2+)胁迫会对其幼虫的生长发育产生影响,而转录组分析有助于揭示Zn2+胁迫影响黑水虻幼虫发育的分子机制.本试验以不同浓度Zn2+(75、150、300、1 200 mg/kg)对黑水虻幼虫进行连续5代胁迫,利用Illumina HiSeq 4 000高通量测序平台对第5代6龄幼虫转录组进行测序及分析.结果显示,Zn2+胁迫影响了第5代黑水虻幼虫的基因表达水平,75、150、300和 1 200 mg/kg Zn2+处理幼虫中上调/下调的差异表达基因分别是1 293/1 839、1 277/2 306、1 080/1 966和1 444/2 170个;GO富集分析结果表明,差异表达基因在细胞过程中所占比例最大,细胞组分中主要是细胞和细胞成分,分子功能中主要为催化活性和细胞结合;KEGG富集差异分析显示,75 mg/kg Zn2+胁迫下差异表达基因主要富集在免疫相关反应、免疫相关信号传导途径及脂类物质代谢,300 mg/kg Zn2+处理组差异表达基因主要富集在氨基酸代谢和碳水化合物代谢;1 200 mg/kg Zn2+胁迫下氨基酸和脂类代谢、免疫相关反应和生长均受到严重影响,这些富集的与上述有关的差异基因大多表达下调.本研究表明,Zn2+胁迫影响了黑水虻幼虫基因表达,高浓度Zn2+胁迫基因表达影响尤为显著,主要表现在细胞过程、催化活性和结合的基因表达下调;高浓度Zn2+胁迫还导致了黑水虻幼虫免疫系统、环境相关信号传导途径和脂质代谢等的紊乱.
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编辑人员丨2天前
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意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程中lncRNA的表达谱和调控作用
编辑人员丨2天前
[目的]解析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)差异表达谱,并揭示差异表达 lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA)在幼虫肠道发育中的调控作用.[方法]基于前期获得的意大利蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道转录组数据(分别为Am4,Am5和Am6),利用相关软件筛选Am4 vs Am5比较组和Am5 vs Am6比较组中的DElncRNA,分析DElncRNA和两个比较组中共同上调和下调lncRNA的顺式调控作用及竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的调控作用.通过RT-qPCR验证转录组数据的可靠性.[结果]在Am4 vs Am5比较组中筛选出214条上调和251条下调lncRNA,在Am5 vs Am6比较组中筛选出141条上调和332条下调lncRNA;两个比较组共有的上调和下调lncRNA分别为7和16条.Am4 vs Am5比较组中的DElncRNA潜在调控250个邻近基因,涉及细胞进程等28个GO条目及Wnt信号通路等58条KEGG通路;Am5 vs Am6比较组中的DElncRNA潜在调控295个邻近基因,涉及细胞部分等35个GO条目及FoxO信号通路等73条KEGG通路;上述两个比较组中共有的7个上调lncRNA潜在调控10个邻近基因,涉及1个GO条目及代谢通路、谷胱甘肽代谢和核质转运等7条KEGG通路.共有的16个下调lncRNA潜在调控27个邻近基因,涉及8个GO条目及精氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢和代谢通路等13条KEGG通路.此外,Am4 vs Am5比较组中的49条DElncRNA可靶向16个差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)进而靶向 122 条差异表达 mRNA(differentially expressed mRNA,DEmRNA),可注释到代谢进程等24个GO条目和Wnt信号通路等21条KEGG通路.Am5 vs Am6比较组中的38条DElncRNA可靶向8条DEmiRNA进而靶向67条DEmRNA,可注释到催化活性等21个GO条目和FoxO信号通路等10条KEGG通路;上述两个比较组共有的1条下调lncRNA MSTRG.10589.2 可靶向 ame-miR-6052 和 miR-511-y,进而靶向 29 条 DEmRNA.RT-qPCR 结果显示随机选取的7条DElncRNA的相对表达量与测序数据一致,证实了所用转录组数据的可靠性.[结论]意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程伴随着lncRNA的动态差异表达,DElncRNA可通过顺式作用和ceRNA网络潜在参与对幼虫肠道发育的调控,在幼虫肠道发育中潜在发挥重要的调控作用.
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编辑人员丨2天前
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一种拉帕替尼衍生物的合成及抗HER2阳性乳腺癌作用研究
编辑人员丨2天前
目的 合成一种拉帕替尼的衍生物,探讨其抗HER2阳性乳腺癌的作用和作用机制.方法 以阿司匹林为酰化试剂,应用Steglich酯化反应,经DCC-DMAP催化合成了乙酰化拉帕替尼(化合物Ⅰ).应用CCK8及平板克隆法考察化合物Ⅰ抗HER2阳性乳腺癌细胞增殖的能力,采用分子对接技术预测化合物Ⅰ的作用靶点,通过Western blot法揭示化合物Ⅰ对BT474细胞AMPK/mTOR通路蛋白的影响.结果 化合物Ⅰ的结构经1H NMR、13C NMR和MS确证.化合物 Ⅰ 对 BT474 细胞的IC50 分别为(112.05+3.21)nmol·L-1(24h)、(35.87±0.79)nmol·L-1(48 h)和(4.98±0.05)nmol·L-1(72 h);化合物 Ⅰ 可显著抑制 BT474 细胞的克隆形成;分子对接结果显示化合物Ⅰ与EGFR、HER2、AMPK、mTOR和AKT1均有较好的结合;Western blot结果显示化合物Ⅰ可显著上调p-AMPK、AMPK,且激动作用较拉帕替尼更强,化合物Ⅰ亦可显著下调EGFR、HER2、p-AKT1、AKT1、p-mTOR和mTOR.结论 化合物Ⅰ较拉帕替尼有更强的抗HER2阳性乳腺癌增殖活性,其主要通过激动AMPK,抑制AKT1和mTOR,调节AMPK/mTOR通路发挥作用.
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编辑人员丨2天前
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低剂量脂多糖诱导下人牙周膜干细胞对巨噬细胞促炎因子表达的影响及其机制研究
编辑人员丨2天前
目的:探讨人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cell,HPDLSC)经低剂量脂多糖作用后,对巨噬细胞促炎因子表达的影响及其机制。方法:培养原代HPDLSC,并以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、100 μg/L或10 mg/L 脂多糖处理48 h,收集各自条件培养基(conditioned medium,CM),分别与人单核白血病细胞(human monocyte leukemic cell,THP-1)源性巨噬细胞共培养48 h,对应实验分组为PBS处理的HPDLSC条件培养基(PBS-treated HPDLSC-derived CM,CM-C)组、低剂量脂多糖处理的HPDLSC条件培养基(low dose lipopolysaccharide-treated HPDLSC-derived CM,CM-L)组和高剂量脂多糖处理的HPDLSC条件培养基(high dose lipopolysaccharide-treated HPDLSC-derived CM,CM-H)组。实时荧光定量PCR检测各组巨噬细胞促炎因子相关基因白介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达;CM-C、CM-L组核因子E2相关因子2 [nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2,NRF2]及其下游抗氧化基因谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸):醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1,NQO1]及血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)mRNA的表达。同时以蛋白质免疫印迹法检测CM-C和CM-L组巨噬细胞胞质与胞核NRF2蛋白、GCLC及HO-1蛋白表达;2′,7′-二氯荧光素探针检测CM-C和CM-L组巨噬细胞内活性氧水平,以平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)表征结果。结果:CM-H组巨噬细胞内促炎因子IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α mRNA表达(2.332±0.594、3.601±0.639、2.120±0.677、2.468±0.236)均较CM-C组(1.000±0.321、1.000±0.151、1.000±0.059、1.000±0.095)显著上调( P<0.05);而CM-L组巨噬细胞内IL-6、IL-12及TNF-α mRNA表达(0.056±0.002、0.215±0.024、0.567±0.071)均较CM-C组(1.000±0.209、1.000±0.220、1.000±0.220)显著下调( P<0.05)。在mRNA水平,NRF2表达在CM-L组(1.864±0.198)较CM-C组(1.000±0.094)显著上调( P<0.05);在蛋白水平,CM-L组巨噬细胞胞质及胞核NRF2表达(1.175±0.104、1.308±0.082)均较CM-C组(1.000±0.025、1.000±0.049)显著升高( P<0.05)。CM-L组巨噬细胞NRF2下游抗氧化基因GCLC、NQO1 mRNA表达(1.786±0.278、1.444±0.078)均较CM-C组(1.000±0.139、1.000±0.226)显著上调( P<0.05),且CM-L组GCLC、HO-1蛋白水平(1.159±0.036、1.412±0.075)均显著高于CM-C组(1.000±0.050、1.000±0.013)( P<0.05)。同时CM-L组巨噬细胞活性氧水平(MFI:123 419±1 302)较CM-C组(MFI:139 193±1 241)显著降低( P<0.05)。 结论:低剂量脂多糖可以诱导HPDLSC激活巨噬细胞NRF2信号通路调控氧化应激反应,下调巨噬细胞促炎因子表达。
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编辑人员丨2天前
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胰岛淀粉样多肽对阿尔茨海默病小鼠脑组织中LncRNA和mRNA表达谱的影响
编辑人员丨2天前
目的:探讨胰岛淀粉样多肽(IAPP)对阿尔茨海默病(AD)小鼠脑组织中长链非编码RNA(LncRNA)和信使RNA(mRNA)表达谱的影响。方法:选取7月龄雄性APP/PS1转基因AD模型小鼠10只,体质量20~30 g。将AD模型小鼠按数字表法随机分为IAPP干预组和对照组,每组5只。IAPP干预组小鼠腹腔内注射0.5 μmol/L的IAPP(200 μg/kg),每日1次。对照组小鼠腹腔注射相同剂量的磷酸盐缓冲液。两组小鼠干预时间均为10周。干预完成后,颈椎脱位处死小鼠,开颅剥离完整脑组织提取总RNA。应用基因芯片技术获得2组小鼠脑组织LncRNA和mRNA表达谱,筛选出差异表达的LncRNA和mRNA。在差异表达的LncRNA和mRNA中随机选取6个LncRNA,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证基因芯片结果的可靠性。将筛选出的差异表达的mRNA与基因本体论(GO)数据库的各条目比对,从分子功能、生物过程和细胞成分3个领域行GO富集分析;使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库行信号通路富集分析。结果:实验过程中小鼠死亡4只,每组2只。IAPP干预组与对照组比较,显著差异表达的LncRNA共有902个,其中显著上调238个、显著下调664个;显著差异表达的mRNA共555个,其中显著上调236个、显著下调319个。qRT-PCR检测验证LncRNA的表达情况,与对照组比较,IAPP干预组AD小鼠脑组织中AK034056、Spock3表达上调,Map3k8、rgs20、Rint、Ppp2r1b表达下调,差异均有统计学意义( P值均<0.05)。qRT-PCR检测结果与芯片结果相符。GO富集分析:555个差异表达的mRNA,富集得到2 224个GO条目,其中显著上调的差异表达mRNA具有蛋白质结合、细胞周期等分子功能,与催化复合物、蛋白质复合物等细胞组分相关,参与了细胞代谢、高分子代谢等生物过程;显著下调的差异表达mRNA具有G蛋白偶联受体活性、跨膜信号受体活性等相关分子功能,与细胞黏附复合物、整合素复合物等细胞组分相关,参与G蛋白偶联受体信号通路、生物过程的调节等生物学过程。KEGG通路富集分析:555个差异表达的mRNA,富集得到62个通路,其中显著上调的差异表达mRNA富集评分较高的通路为神经退行性变的途径、阿尔茨海默病通路、氧化磷酸化通路、GABA能突触通路等,显著下调的差异表达mRNA富集评分较高的通路为钙信号通路、趋化因子信号通路、磷酸肌醇代谢通路、神经活性配体-受体相互作用通路、白细胞介素-17信号通路等。 结论:IAPP干预使AD小鼠脑组织 LncRNA、mRNA表达谱发生显著变化。差异表达的mRNA分别参与多种不同的生物学过程,差异表达的LncRNA可能通过调控相关mRNA的表达,发挥其生物学功能。
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编辑人员丨2天前
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消旋山莨菪碱在照射诱导肺上皮细胞损伤中的保护作用
编辑人员丨2天前
目的:探讨消旋山莨菪碱(654-2)对X射线诱导小鼠肺上皮细胞损伤的保护作用及潜在机制。方法:利用小鼠肺泡上皮细胞MLE-12单次大剂量X线照射建立体外放射性肺损伤(RILI)模型,细胞分组为:对照组(未照射)、照射组(16 Gy照射)、处理1组(16 Gy照射+2 μmol/L 654-2)、处理2组(16 Gy照射+10μmol/L 654-2)、抑制剂组(16 Gy照射+10 μmol/L 654-2+2 μmol/L ML385)。照射后不同时间点收集细胞进行相关检测。细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老;细胞集落形成能力检测观察细胞处理后的恢复能力;蛋白质印迹法检测p21、p16、磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、Nrf2 Ser40位点磷酸化(p-Nrf2)、p62、血红素氧合酶1(HO-1)、NAD(P)H醌脱氢酶1(NQO1)等蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内总活性氧(ROS)产生;按照相关试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD);实时反转录PCR检测检测谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)等mRNA表达情况。计量资料以 xˉ±s表示,两组间比较采用独立样本 t检验,多组间比较采用单因素方差分析。 结果:与照射组相比,处理1、2组细胞SA-β-Gal染色阳性细胞比例减少,细胞衰老减轻( P均<0.001)。与照射组相比,处理2组的γH2AX蛋白表达减少( P=0.037),细胞凋亡减少( P=0.026),细胞增殖能力增强( P=0.004),GSH( P=0.002)、SOD( P<0.001)活力提高,且ROS减少( P=0.001)。随着654-2的作用时间延长,MLE-12细胞的总蛋白中Nrf2、p-Nrf2的表达增强,同时Nrf2下游抗氧化蛋白NQO1及HO-1的表达增强,GCLC及GCLM mRNA表达增强。当加入Nrf2小分子抑制剂ML385后,抑制剂组的SA-β-Gal染色阳性细胞数( P=0.145)、ROS( P=0.317)与照射组的差异无统计学意义。 结论:654-2可以激活Nrf2通路,增强细胞抗氧化能力,抑制细胞衰老,从而发挥对RILI的保护作用。
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编辑人员丨2天前
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Y1转座酶关联转座子在大肠杆菌和沙门氏菌基因组中的分布和结构特征
编辑人员丨2天前
Y1 转座酶关联转座子(Y1ATs)的活性催化位点为一个酪氨酸,能够切割和连接单链DNA,在原核生物分布广泛.为探究Y1 转座酶关联转座子在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)与沙门氏菌(Salmonella enterica,S.ente)基因组中系统进化特性,通过Hmmsearch程序对Y1 转座酶关联转座子进行了挖掘分析.结果表明,Y1 转座酶关联转座子广泛分布于96.84%大肠杆菌基因组和 80.4%沙门氏菌基因组.根据序列比对和蛋白结构域预测将Y1 转座酶关联转座子分为10 类,均隶属于IS200/IS605 超家族,其中 11 645 个属于IS200 家族,4 811 个属于IS605 家族.IS200 家族广泛分布于S.ente基因组中(72.24%),而IS605 家族广泛分布于E.coli基因组中(89.38%).IS200 拷贝数以及完整拷贝数显著高于IS605.IS200 家族仅含有一个Y1转座酶编码区,而IS605 家族含两个开放阅读框,分别编码Y1 转座酶和TnpB蛋白.IS200 家族的Y1 氨基酸序列高度保守(95.3%),而IS605 家族的Y1 和TnpB具有较高遗传多样性,为研究转座子在原核生物的遗传进化模式提供重要参考.IS200家族具有高度保守的Y1 转座酶,且完整拷贝数比例较高,提示该类转座子可能具有转座活性,对其活性的挖掘有利于研制转座子介导的新型高效基因编辑工具.
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编辑人员丨2天前
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Hunter综合征家系的临床表型、遗传学特征及永生化细胞系的构建
编辑人员丨2天前
目的:探讨1个Hunter综合征家系的临床表型和遗传学特征,并为其构建永生化类淋巴母细胞系。方法:选取2022年7月就诊于西安市儿童医院的1例Hunter综合征患儿及其家系成员(2代共6人)作为研究对象。回顾性分析患儿的临床资料,对其进行家系全外显子组测序,对候选变异进行Sanger测序家系验证,并进行生物信息软件分析。通过EB病毒转染构建患儿及其父母的外周血B淋巴细胞永生化细胞系并进行酶活性分析。结果:患儿为5岁7月龄男性,表现为手足关节不能伸直、四肢关节大,3月龄出现疝气、舟状头、桶状胸等。患儿的舅舅表现为四肢关节不能伸直、听力差、失明、右侧腹股沟斜疝等。基因检测显示患儿及其舅舅均携带 IDS基因(NM_000202.8)c.823G>A(p.D275N)变异。生物信息学分析表明,D275是一个具有高度保守性的位点,D275N变异可能会影响蛋白质空间构象的稳定性,从而降低酶的催化活性。患儿及其父母的永生化类淋巴母细胞系在构建过程中细胞体积增大、呈不规则形状,周围存在毛刺状结构和聚团生长。患儿永生化类淋巴母细胞的IDS酶活值低于检测限。根据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)相关指南, IDS: c.823G>A(p.D275N)被评级为可能致病变异(PS3+PM2_Supporting+PM5+PP1+PP3)。 结论:IDS:c.823G>A考虑为该Hunter综合征患儿手足关节不能伸直、四肢关节大的遗传学病因。永生化细胞系的构建为进一步研究上述变异对IDS功能的影响提供了细胞模型。
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编辑人员丨2天前
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线粒体细胞色素C氧化酶I的研究进展
编辑人员丨2天前
线粒体细胞色素C氧化酶(mitochondrial cytochrome coxidase,mt-COX,E .C .1.9.3.1)是线粒体呼吸链的复合物Ⅳ(complex IV),是呼吸链末端的限速酶,参与能量供应、细胞凋亡、新陈代谢、活性氧产生等重要的生理过程。由于哺乳动物中95%的氧是通过mt-COX催化处理后被利用的,mt-COX在能量产生与调节中起着重要作用,成为研究热点。研究表明,细胞色素C氧化酶异常涉及多种疾病,尤其mt-COXI是其核心基团,深入研究具有重要意义。文章就线粒体细胞色素C氧化酶I的研究进展及其与相关疾病的关系进行综述。
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编辑人员丨2天前
