目的:研究蜂蜇草萃取物对胡蜂蜂毒致人红细胞溶血的拮抗作用。方法:采用水提取法对干蜂蜇草进行萃取，真空干燥获得蜂蜇草萃取物，配制成1 g/L备用；从胡蜂工蜂尾部收集蜂毒原液备用。获取A、B、O、AB型健康献血者悬浮红细胞液制成洗涤红细胞，调节红细胞计数（4.0～80.0）×10 9/L（血细胞计数板上计数红细胞数量1～20个/小格），按处理因素分成生理盐水对照组（NS组，红细胞液200 μL +生理盐水20 μL）、蜂蜇草萃取物组（FZC组，红细胞液200 μL+蜂蜇草萃取物10 μL +生理盐水10 μL）、蜂毒组（FD组，红细胞液200 μL+蜂毒10 μL+生理盐水10 μL）、蜂蜇草萃取物+蜂毒组（FCD组，红细胞液200 μL +蜂蜇草萃取物10 μL +蜂毒10 μL），每组10份。将各组溶液置于玻璃试管中，放入37 ℃温箱，10 min后于显微镜下直接观察血细胞计数板并进行红细胞计数，比较不同血型相同处理因素之间以及相同血型不同处理因素组之间红细胞计数的差异。 结果:在相同处理因素下，各血型间红细胞计数差异无统计学意义，NS组中A、B、O、AB型红细胞计数（×10 9/L）分别为5.567±1.368、5.146±1.690、4.577±0.774、5.197±1.587（ F＝0.852， P＝0.475），FZC组分别为5.751±1.489、5.268±1.418、4.727±1.174、5.298±1.229（ F＝0.987， P＝0.410），FD组分别为0.546±0.450、0.804±0.428、0.679±0.283、0.846±0.453（ F＝1.089， P＝0.366），FCD组分别为5.532±1.330、5.051±1.596、4.589±0.879、5.140±1.492（ F＝0.820， P＝0.492）。相同血型不同处理因素组间比较红细胞计数：在FZC组与NS组间比较差异无统计学意义，说明蜂蜇草萃取物对红细胞溶血无影响；而在FD组则明显低于NS组（均 P<0.05），说明蜂毒对红细胞有明显的溶血作用；但在FCD组与NS组间比较红细胞计数差异也无统计学意义，说明蜂蜇草萃取物拮抗蜂毒的溶血作用而不影响红细胞计数；而FCD组红细胞计数明显高于FD组（均 P<0.05），进一步说明蜂蜇草萃取物拮抗蜂毒的溶血作用。 结论:胡蜂蜂毒具有明显的溶血作用，而蜂蜇草萃取物能有效拮抗蜂毒的溶血作用；蜂毒的溶血作用与人ABO血型无关。

本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的腺苷酸激酶(Adenylat kinase,ADK)NcADK的理化性质和分子特性,并检测NcADK基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中的表达特征,以期丰富NcADK相关信息,并为进一步的功能研究提供依据.利用相关生物信息学软件预测和分析NcADK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构.使用MEME软件和Batch CD-Search工具分别预测东方蜜蜂微孢子虫和其它7种微孢子ADK蛋白的保守基序和保守结构域.通过Mega 11.0软件基于ADK氨基酸序列构建进化树.采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中NcADK的相对表达量.结果表明,NcADK的CDS含有540个核苷酸,可编码179个氨基酸;NcADK的分子量约为20.66 kDa,分子式为C903H1488N258O278S8,脂肪系数为100.61,平均亲水系数为-0.502,等电点为6.83,含29个负电荷氨基酸和29个正电荷氨基酸;NcADK可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核、囊泡和过氧化物酶体;NcADK含20个磷酸化位点,不含典型的信号肽;NcADK含88个a-螺旋,24条延长链,17个β-转角,50个无规则卷曲,与模板A0A0F9WEU7.1.A之间的序列同源性为100％;在东方蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis、按蚊微孢子虫 Anncaliia algerae 和角膜条孢虫 Vittaforma corneae ADK 中均鉴定到 1 个相同的结构域和5个相同的保守基序;东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis的ADK在进化树上聚为一支.相较于接种后1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcADK的表达量在2 dpi上调但无显著差异(P＞0.05),在3 dpi和4 dpi均显著上调(P＞0.05).研究结果明确了NcADK的理化性质和分子特性,并揭示NcADK是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,不同微孢子虫的ADK具有较强的保守性,东方蜜蜂微孢子虫及其姐妹种蜜蜂微孢子虫的ADK具有高同源性,NcADK在3 dpi和4 dpi被激活表达.

为了探究蜜蜂越冬期体内卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)的表达特性.本试验分别采集夏繁期(7月)和不同越冬时期(11月、12月、1月、2月)的珲春黑蜂工蜂,通过酶联免疫吸附试验方法检测Vg、JH Ⅲ及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的浓度变化,采用qRT-PCR方法检测Vg、JH代谢相关基因的表达量.结果表明:珲春黑蜂越冬期Vg浓度高于夏繁期,在不同越冬期Vg浓度总体呈现先上升后下降的趋势;Vg基因的变化趋势与Vg浓度相一致,而VgR基因表达量与SOD浓度变化趋势相一致,在越冬期水平高于夏繁期,且在整个越冬期呈现下降的趋势.珲春黑蜂越冬期JH Ⅲ浓度低于夏繁期,且随着越冬持续进行总体呈现持续上升的变化趋势;MFE基因的变化趋势与JH Ⅲ浓度相近;JHAMT基因表达量越冬期显著高于夏繁期,在整个越冬期呈现先上升后下降的趋势.本研究结果表明,蜜蜂越冬期体内存在Vg和JH Ⅲ间负相关的调节模型,其通过Vg、JH Ⅲ代谢相关基因的表达来提高越冬蜂抗氧化能力和抗寒性,为西方蜜蜂抗寒分子机制的深入研究提供了新的研究思路.

[目的]将已获得的中华蜜蜂Apis cerana cerana转录组纳米孔长读段数据比对到东方蜜蜂A.cerana参考基因组,进行注释基因的结构优化,鉴定未注释的新基因和新转录本并进行功能注释以及预测其SSR位点、完整ORF和转录因子(transcription factor,TF)家族及成员的分析验证,完善现有的东方蜜蜂参考基因组序列和功能注释.[方法]基于已获得的高质量的接种蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis的中华蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道转录组纳米孔测序数据,使用gffcompare软件将已鉴定到的全长转录本比对到东方蜜蜂参考基因组以优化已注释基因的结构;采用gffcompare软件鉴定参考基因组上未注释的新基因和新转录本,再通过比对Nr,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库进行功能注释;使用MISA,TransDecoder v3.0.0和animalTFDB 2.0软件分别预测SSR位点、完整ORF和TF家族及成员.[结果]共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的4 648个基因结构进行了优化,对1 336个基因同时延长了 5'UTR和3'UTR,分别延长了 1 688个基因的5'UTR和1 624个基因的3'UTR;共鉴定到2 148个新基因,其中分别有818,298,587,359和333个新基因可注释到Nr,KOG,eggNOG,GO和KEGG数据库;共鉴定到35 432条新转录本,其中分别有30 974,21 222,29 025,19 852和9 214条新转录本可注释到上述5个数据库;共发掘出22 541个SSR位点,其中单、双、三和六碱基重复的SSR数量分别为12 078,7 140,2 825和43个,混合SSR的数量为2 964个,分布频率最高的类型是单碱基重复(153.37个/Mb);共预测到58个TF家族及1 611个成员;共预测出28 775个完整ORF,其中编码长度分布在100～200个氨基酸的ORF(38.99％)最多.[结论]研究结果优化了东方蜜蜂参考基因组上已注释基因的结构,并补充了参考基因组上未注释的新基因、新转录本、SSR、完整ORF及TF.

[目的]通过纳米孔(nanopore)测序技术组装和注释中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道高质量全长转录组.[方法]采用Nanopore PromethION系统对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis接种的中华蜜蜂工蜂3日龄幼虫后的4,5和6日龄幼虫肠道(分别为AcT4,AcT5和AcT6)进行转录组测序,鉴定全长转录本序列;将前期未接种蜜蜂球囊菌中华蜜蜂工蜂4,5和6日龄幼虫肠道转录组纳米孔测序数据中鉴定到的全长转录本与上述鉴定到的全长转录本混合后滤除冗余全长转录本;将鉴定到的非冗余全长转录本比对Nr,KOG,eggNOG和GO数据库进行注释.采用CPC,CNCI,CPAT和Pfam 4种方法预测长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA).[结果]AcT4,AcT5 和 AcT6 分别测得 14 474 634,10 461 827 和 11 890 978 条原始读段(raw reads),分别包含11 898 582,8 630 186和9 091 035条全长转录本,去冗余后分别鉴定到27 815,21 781和20 004条非冗余全长转录本,N50长度分别为1 900,1 961和2 294 bp,平均长度分别为1 534,1 584和1 792 bp,最长读段长度分别为10 855,10 837和10 887 bp.鉴定到40 562条去非冗余全长转录本,分别有35 415,24 646,34 054和23 053条转录本可分别注释到Nr,KOG,eggNOG和GO数据库.在Nr数据库中注释全长转录本数目和占比最高的物种是东方蜜蜂A.cerana(20 310条,57.35％),其次为西方蜜蜂4.mellifera(4 686条转录本,占13.23％)、大蜜蜂A.dorsata(2 536条转录本,占7.16％)和小蜜蜂A.florea(2 079条转录本,占5.87％).非冗余全长转录本可注释到eggNOG数据库中的未知功能及翻译后修饰、蛋白质更新和分子伴侣等25个功能分类、KOG数据库中的仅一般功能预测和信号转导机制等25个功能分类、GO数据库中生物学进程、细胞组分和分子功能三大类中的50个功能条目以及KEGG数据库中核糖体和RNA转运等196条通路.共鉴定到2 301条高可信度lncRNA,涉及正义链lncRNA、反义链lncRNA、内含子lncRNA和基因间区lncRNA 4种类型.[结论]成功构建和注释了中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的首个全长转录组,为中华蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana其他亚种的分子生物学及组学研究提供了高质量参考背景和关键基础.

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物中分布广泛、含量丰富且作用关键的一类RNA修饰.东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae专性侵染成年蜜蜂导致微孢子病,给养蜂业造成很大损失.本研究对东方蜜蜂微孢子虫的甲基转移酶样蛋白 5(Methyltransferase-like protein 5,Mettl5)基因 NcMettl5 进行克隆,通过生物信息学预测 NcMettl5 蛋白的理化性质和分子特性,并通过RT-qPCR检测NcMettl5在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程的相对表达量,以期丰富NcMettl5的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子侵染中NcMettl5的功能及调控机制提供基础.结果表明,扩增出约 600 bp的目的片段,与GenBank数据库收录的预测出的NcMettl5序列一致;NcMettl5 的分子量约为 22.64 kDa,分子式为 C1039H1645N269O284S6,理论等电点是9.37,脂溶系数是98.98,不稳定系数为13.96;包含196个氨基酸和20个磷酸化位点;平均亲水系数为-0.230,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞骨架、细胞质和细胞核、细胞核、线粒体和过氧化物酶体;NcMettl5 含有 1 个超家族结构域:AdoMet_MTases superfamily;东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫Nosema bombycis CQ1 和颗粒病微孢子虫Nosema granulosis的Mettl5均含有 7 个相同的保守基序,序列一致性较高,且进化距离较近;NcMettl5 在东方蜜蜂微孢子虫接种后 1-4 d的意大利蜜蜂工蜂中肠内均有表达;相较于接种后 1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcMettl5 的表达量在 2 dpi和 3 dpi下调但差异不显著(P＞0.05),在 4 dpi显著下调(P＜0.05).研究结果表明成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫的 NcMettl5 基因,明确了 NcMettl5 蛋白的分子特性,并揭示NcMettl5 可能为亲水性蛋白、非跨膜蛋白和胞内蛋白,Nosema 属的东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫和颗粒病微孢子虫的Mettl5 蛋白具有较高的保守性,NcMettl5 在东方蜜蜂微孢子虫增殖周期内真实表达且总体呈持续下降的表达趋势.

[目的]利用代谢组学分析患枣花病意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠内代谢物变化,挖掘出与蜜蜂枣花病相关的重要代谢通路,旨在揭示蜜蜂枣花病发病机制,为枣花病靶向药物的研发提供理论依据.[方法]分别利用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和气相色谱.质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术对患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂进行中肠非靶向代谢组检测;通过主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),以变量投影重要性(variable projection importance,VIP)＞1.0,差异倍数(fold change,FC)＞2.0和P＜0.05为标准筛选差异代谢物,并对其进行KEGG注释和通路富集;利用生化方法测定意大利蜜蜂工蜂中肠中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性,并通过qRT-PCR测定抗氧化基因Sod1,Sod2和CAT及免疫基因Defensin,Hymenoptaecin,Apidaecin和Abaecin在中肠内的表达量.[结果]基于LC-MS代谢组检测,正离子和负离子模式下分别获得患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂间差异代谢物49和43种,其中分别有33和30种能够在HMDB和KEGG数据库中鉴定到.基于GC-MS代谢组检测,患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂间筛选到22种挥发性差异代谢物,其中11种能够在HMDB和KEGG数据库中鉴定到.与健康意大利蜜蜂工蜂相比,患枣花病意大利蜜蜂工蜂中肠内经鉴定的73种差异代谢物中,28种含量上升,45种含量下降;其中,京尼平苷酸、吲哚-3-乙酸、喹啉和棉子糖在患枣花病意大利蜜蜂工蜂中肠内大量积累,而乌索酸、L-苏糖酸、葡萄糖酸、D-半乳糖酸、苏糖酸和芦丁的含量下降最为明显.KEGG代谢通路富集分析结果表明,患枣花病和健康意大利蜜蜂工蜂间差异代谢物显著富集在抗坏血酸和醛酸代谢、半乳糖代谢及丁酸甲酯代谢这3条碳水化合物代谢通路.酶活性测定及qRT-PCR结果显示,与健康意大利蜜蜂工蜂相比,患枣花病意大利蜜蜂工蜂中肠中SOD和CAT酶活显著降低,Sod1,Sod2,CAT,Defensin,Hymenoptaecin和Apidaecin的表达量均呈下调趋势.[结论]利用LC-MS和GC-MS非靶向代谢组学均能够有效地分析枣花病影响下蜜蜂中肠内代谢物的变化差异.研究结果表明,意大利蜜蜂采集枣花后其中肠内碳水化合物代谢发生异常,引起肠道抗氧化和免疫能力显著下降,推测肠道功能障碍是导致蜜蜂死亡的主要原因.该研究为蜜蜂枣花病的发病机理提供了新见解.

[目的]本研究旨在克隆西方蜜蜂Apismellifera RNA m6A甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式,并制备AmMETTL14多克隆抗体,为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础.[方法]通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证.使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析,并构建系统进化树.通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白,免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性.采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量.[结果]成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C1957H3113N567O589S15,分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质;西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerania、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲 熊蜂 Bombus terrestris、金环胡蜂 Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂 B.impatiens 和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60％)且亲缘关系最近.制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512K)且特异性较强.AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量,在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量,在6,12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量;AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量.[结论]研究结果表明,AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白,AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用,制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强,为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础.

[目的]本研究旨在筛选西方蜜蜂Apis mellifera采集蜂咽下腺中高表达的基因,为进一步筛选和研究蜜蜂采集行为相关基因提供依据.[方法]基于前期已获得西方蜜蜂3日龄工蜂(3d_W)、10日龄哺育蜂(10 d_N)、10日龄采集蜂(10 d_F)、21日龄哺育蜂(21 d_N)和21日龄采集蜂(21 d_F)的咽下腺转录组数据,筛选咽下腺差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并对10日龄和21日龄采集蜂咽下腺中高表达的DEGs进行GO和KEGG富集分析;利用qPCR检测西方蜜蜂采集蜂咽下腺中高表达的4个DEGs(LOC409889,LOC406114,LOC408453和LOC100578735)在不同发育时期(卵、幼虫、蛹、刚出房工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄采集蜂)和21日龄采集蜂组织(腹、胸、触角、上颚腺、咽下腺、蛰针、足、肠道、翅和脑)中的表达量.[结果]比较转录组结果表明,164个上调表达的DEGs在21日龄采集蜂咽下腺中的表达量明显高于在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂咽下腺中的表达量,且在10日龄采集蜂咽下腺中的表达量也高于在10日龄哺育蜂咽下腺中的表达量;105个下调表达的DEGs的表达趋势与上述164个DEGs的相反.GO分析结果表明,10日龄和21日龄采集蜂咽下腺中高表达的164个DEGs显著富集于硫酸盐跨膜转运蛋白活性、硫化合物跨膜转运蛋白活性、铁离子结合和氧化还原酶活性;下调表达的105个DEGs显著富集于核糖体、细胞内核糖核蛋白复合物和核糖核蛋白复合物;KEGG通路分析结果表明,105个下调表达的DEGs显著富集于核糖体以及淀粉和蔗糖代谢两个通路.qPCR 检测结果显示,LOC409889,LOC406114,LOC408453 和 LOC100578735 均在 21 日龄采集蜂中表达量最高;LOC406114和LOC100578735在21日龄采集蜂咽下腺中的表达量最高,而在其他组织中表达量较低或不表达.[结论]本研究通过比较转录组筛选鉴定了西方蜜蜂采集蜂咽下腺中高表达的DEGs,为深入研究采集蜂咽下腺的功能提供了数据,同时也为研究西方蜜蜂的采集行为及采集力强蜂种的分子选育提供新的视角.

为分析草甘膦与微塑料对西方蜜蜂 Apis mellifera 存活和行为的影响.本研究利用 50%蔗糖溶液配置的400 mg/L草甘膦、50 mg/L微塑料以及两者混合物,分别饲喂 1 日龄的工蜂;每日记录西方蜜蜂的存活率,20 d后通过伸吻反应测定它们对蜜蜂嗅觉学习行为的影响.结果发现400 mg/L草甘膦处理蜜蜂 20d后,与对照组相比,蜜蜂存活率下降了 22%,伸吻比率下降了 30%;50 mg/L微塑料处理,与对照组相比,蜜蜂存活率下降了9%,伸吻比率下降了10%;用400 mg/L草甘膦与50 mg/L微塑料协同处理20d后,与对照组相比,蜜蜂死亡率为50%、伸吻比率下降了45%左右.结果表明草甘膦和微塑料均会导致西方蜜蜂存活率降低,影响其糖反应行为,而两者协同处理对西方蜜蜂的影响更显著.