目的:探讨唑尼沙胺（zonisamide, ZNS）对创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）细胞模型的保护作用及其机制。方法:体外培养人神经母细胞瘤（human neuroblastoma cells, SH-SY5Y）细胞，按随机数字表法分为对照组（Control组）、糖氧剥夺组（OGD组）和给药组（OGD+ZNS组）。采用糖氧剥夺法建立创伤性脑损伤细胞模型。造模后，检测细胞活性；检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放情况；β-半乳糖苷酶试剂盒对细胞染色，观察细胞衰老情况；线粒体红色荧光探针（Mito Tracker Red）、JC-1线粒体膜电位试剂盒对线粒体染色，观察线粒体形态及膜电位变化；检测细胞ATP浓度；从SH-SY5Y细胞中提取蛋白，用蛋白质印迹法（Western blot）法检测内质网应激相关指标：葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78），增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein antibody，CHOP）、蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）以及内参β-肌动蛋白（β-actin）的表达变化。结果:OGD组细胞存活率较Control组明显减少（ P<0.01），OGD+ZNS组细胞存活率较OGD组明显增加（ P<0.01）；OGD组LDH释放率较Control组明显增加（ P<0.01），OGD+ZNS组LDH释放率较OGD组明显减少（ P<0.01）。细胞染色结果显示，与Control组和OGD+ZNS组相比，OGD组细胞明显受损衰老严重，染色更深。线粒体染色结果显示，与Control组和OGD+ZNS组相比，OGD组线粒体线性连接明显减少，线粒体活性明显下降。与Control组和OGD+ZNS组相比，OGD组细胞线粒体染色红色荧光明显减弱，绿色荧光明显增强，线粒体膜电位明显下降；OGD组ATP浓度较Control组明显下降（ P<0.01），OGD+ZNS组ATP浓度较OGD组明显上升（ P<0.01）。Western blot结果显示OGD组GRP78、CHOP、PDI表达较Control组明显增加（ P均<0.05），OGD+ZNS组GRP78、CHOP、PDI较OGD组明显下降（ P均<0.05）。 结论:唑尼沙胺可以通过保护线粒体活性以及抑制内质网应激保护创伤性脑损伤糖氧剥夺细胞模型。

目的:应用高通量二维PCR技术（2D-PCR），建立一种单管一步法检测和鉴定宫颈细胞中16种高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82）、 p53（rs1042522）和 RB1（rs3092905）基因型的方法。 方法:根据16种不同亚型HR-HPV、 p53及 RB1基因DNA序列设计特异性引物，同时将待测靶基因 p53及 RB1基因作为评判标本取样及PCR扩增成功与否的内参基因。在3个荧光检测通道中，采用相应标签标记不同亚型HR-HPV、 p53及 RB1的上游引物，并构建完善的2D-PCR检测体系。应用该方法检测804份来源于常州市第一人民医院2022年12月至2023年8月妇科门诊的宫颈刷样本，将检测结果与PCR-反向点杂交法、流式荧光杂交法、单重实时荧光定量PCR法分别进行一致性比较；同时采用Sanger测序法检测 p53和 RB1的基因型。采用 Kappa检验评价2D-PCR法和其他方法间的一致性。 结果:2D-PCR可通过FAM、HEX和Alexa Fluor568通道的特征性熔解谷对16种HR-HPV型别和 p53、 RB1的基因型进行准确区分和鉴定。2D-PCR法与PCR-反向点杂交法具有较高的一致性（ Kappa=0.699），与流式荧光杂交法具有更高的一致性（ Kappa=0.793），和单重荧光定量PCR法的一致性 Kappa=0.880（95% CI 0.862~0.907）。以Sanger测序法为金标准，2D-PCR法检测 p53、 RB1基因型的准确度为100%。 p53 rs1042522 位点3种基因型（G/G型、G/C型和C/C型）的分布频率为32.09%（258/804）、49.88%（401/804）和18.03%（145/804）， RB1 rs3092905位点检出基因型均为A/A型。 结论:成功开发了一种2D-PCR方法，用于高危型HR-HPV型别鉴定与宫颈癌相关肿瘤抑制基因 p53和 RB1的基因分型。

该研究建立了芦蒿废弃茎叶的UPLC指纹图谱及5个酚酸类成分的一测多评法(quantitative analysis of multi-compo-nents by single marker,QAMS).采用 Waters Acquity UPLC BEH C)8 色谱柱(2.1 mm× 100 mm,1.7 μm),流动相为 0.1％磷酸水-乙腈,梯度洗脱,流速0.3 mL·min-1,检测波长330 nm,柱温30 ℃,进样量2 μL.对指纹图谱的数据进行相似度评价及聚类分析,确定13批次芦蒿废弃茎叶中的15个共有成分.以绿原酸为内参物,分别计算阿魏酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的相对校正因子,实现了芦蒿废弃茎叶中5个成分含量测定的一测多评法的建立.同时采用外标法测定此5个成分的含量,结果显示一测多评法与外标法测定结果无显著性差异.结果表明,不同品种和不同产地的芦蒿废弃茎叶中的酚酸类成分含量存在明显差异,且木质化后的芦蒿废弃物中的酚酸类含量较未木质化显著提升.综上所述,该研究建立的芦蒿废弃茎叶一测多评法能够快速准确、简便经济地用于芦蒿废弃茎叶中5个酚酸成分的含量测定,为芦蒿废弃茎叶的资源化开发利用奠定了基础.

目的 本研究旨在建立一种实时荧光定量 PCR 方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平.方法 使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的 ABCG2 核苷酸序列号 NM_001032919.1 及内参 GAPDH 核苷酸序列号NM_001195426.1,借助 Primer premier 5.0 软件设计 PCR 引物.提取猕猴新鲜肾组织的总 RNA,并反转录合成cDNA.接着,利用 PCR引物进行实时荧光定量 PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析 ABCG2 的mRNA相对表达水平.结果 PCR 产物测序结果显示,扩增的 ABCG2 和 GAPDH 核苷酸序列与 NCBI 上猕猴的序列同源性分别为 90.91%和 91.14%.ABCG2 和 GAPDH的扩增效率均达到 80%～120%,实时荧光定量 PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2 接近 1.结论 本研究建立的检测猕猴 ABCG2 mRNA 实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础.

目的 确定用蛋白质印迹(WB)技术研究细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)时适宜的内参蛋白.方法 选取多种人源肿瘤细胞系,通过瞬时转染shRNA质粒下调细胞内Skp2蛋白水平,用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)与β-肌动蛋白(β-actin)作为内参蛋白进行WB检测,分析GAPDH、β-actin、Skp2的相对表达水平及相互关系.结果 细胞内Skp2相对表达水平发生改变时,对于人非小细胞肺癌细胞H1299(1.32 × 106±7.86 × 104)、人宫颈癌细胞HeLa(6.59 ×106±1.79×106)和人肝癌细胞 HepG2(3.13 × 106±2.87 × 105)的GAPDH相对表达水平均发生明显变化(均P＜0.05).相关性结果显示:对于人非小细胞肺癌细胞 A549(R=0.825 8)和 H1299(R=0.906 2),Skp2 与 GAPDH相对表达水平均存在一定的相关性(均P＜0.05).结论 β-actin更适合作为研究Skp2蛋白WB实验的内参蛋白.

目的 比较幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与非Hp感染的慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)患者胃黏膜病理状态与刺猬蛋白-细胞表面受体Ptch-G蛋白偶联受体样蛋白Smo-胶质瘤相关癌基因同源蛋白Gli(Hedgehog信号通路,Hh-Ptch-Smo-Gli)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶/核因子κB/转录信号转导子和转录活化子1(NOX/NF-κB/STAT1)信号通路相关因子表达差异,探究Hp促进CAG"炎癌转化"的生物学机制.方法 纳入符合标准的43名CAG患者,分为CAG伴Hp感染组(Hp+CAG组,n=21)、CAG不伴Hp感染组(Hp-CAG组,n=22),观察两组患者胃黏膜苏木精-伊红(HE)染色组织形态学改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测胃黏膜NOX1、NOX2、NOX4、STAT1、P65、p-P65相对表达量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测胃黏膜胶质瘤相关癌基因同源蛋白1 mRNA(Gli1 mRNA)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白2 mRNA(Gli2 mRNA)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白3 mRNA(Gli3 mRNA)、音猬因子mRNA(Shh mRNA)、G蛋白偶联受体样蛋白mRNA(Smo mRNA)、细胞表面受体Ptch mRNA(Ptch mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1 mRNA(NOX1 mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 mRNA(NOX2 mRNA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 mRNA(NOX4 mRNA)、核因子κB mRNA(NF-κB mRNA)水平.结果 两组患者胃组织HE染色结果:Hp+CAG组患者胃黏膜上皮细胞部分坏死脱落,表面欠光整,腺体数量减少,排列紊乱,可见肠上皮化生,固有层内可见弥漫性淋巴细胞、中性粒细胞浸润;Hp-CAG组患者淋巴细胞和中性粒细胞浸润程度较Hp+CAG组轻.RT-qPCR检测结果:与Hp-CAG组相比,Hp+ CAG组患者胃黏膜Gli1 mRNA、Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA水平显著降低(P<0.01);Gli2 mRNA、Gli3 mRNA、NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA、NF-κB mRNA水平显著增高(P<0.01).Western blot检测结果:与Hp-CAG组相比,Hp+CAG组患者胃黏膜NOX1/GAPDH(内参)、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH、p-P65/GAPDH相对表达量明显增高(P<0.01),STAT1水平显著降低(P<0.01),两组P65/GAPDH相对表达量的差异没有统计学意义(P>0.05).结论 Hp感染后可能通过抑制Hh-Ptch-Smo-Gli信号通路,并使NOX/NF-κB/STAT1信号通路异常活化,导致胃黏膜长期炎症,促进萎缩及肠上皮化生,增加癌变风险.

目的 采用SYBR Green Ⅰ染料建立实时定量PCR法检测CHO细胞外源抗体轻链(light chain,LC)、重链(heavy chain,HC)基因拷贝数,并进行方法的验证及初步应用.方法 以CHO细胞中稳定表达的B2m(β2-microglobulin)基因作为内参基因,分别设计适宜的LC和HC基因引物及内参基因引物,确定实时定量PCR方法的反应体系和反应程序.对建立的方法进行特异性、线性、精密性及耐用性验证,并采用建立的方法检测重组细胞株工作细胞库(WCB)及不同传代次数细胞中LC和HC基因拷贝数.结果 外源基因与内参基因引物可特异性结合目标片段;B2m、LC、HC基因引物扩增效率分别为106.7％、106.3％和99.1％,线性方程相关系数均大于0.99,具有良好的线性关系;精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1％;短时间内少次冻融对检测结果影响较小.利用建立的方法检测不同代次重组细胞株LC和HC基因拷贝数,未见明显变化.结论 成功建立了 CHO细胞外源基因拷贝数实时定量PCR检测方法,该方法特异性、线性、精密性及耐用性良好,为其他CHO细胞株表达的外源基因拷贝数检测提供了参考.

目的 探索内源性内参在判断新型冠状病毒核酸标本检测实验室污染中的应用效果.方法 采取现场采样和检测方法,对某医院新型冠状病毒核酸检测实验室内源性内参检出情况进行调查和分析,并对不同消毒方法清除内源性内参效果进行评价.结果 实验室内各区域均可检出内源性内参,主要分布在移液器、门把手、试验台面、生物安全柜和核酸提取仪等高频接触物体表面.采用含氯消毒剂和75%乙醇消毒湿巾擦拭消毒,均可明显降低重点区域内源性内参检出率.结论 新型冠状病毒核酸检测实验室应定期监测内源性内参污染,对重点区域加强清洁消毒工作,以有效避免标本污染.

目的 筛选并分析刚地弓形虫慢性感染小鼠脑转录组差异表达基因(DEG),分析与抑郁相关的犬尿氨酸(KYN)通路DEG的相对转录水平,为探究弓形虫慢性感染导致小鼠抑郁样症状的机制提供理论依据.方法 18只SV129雄性小鼠随机平均分为感染组和对照组.感染组小鼠腹腔注射ME49株速殖子120个(200 μl),对照组注射等体积的磷酸缓冲液,感染后3个月收集感染组和对照组小鼠脑组织,提取小鼠脑组织总RNA进行转录组测序,筛选DEG,对DEG进行聚类分析、基因本体(GO)功能注释分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析.选取与抑郁症相关的KYN通路的8个DEG,分别为 γ 干扰素(IFN-γ)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、IDO2、犬尿氨酸酶(KYNU)、犬尿氨酸-3-单氧化酶(KMO)、3-羟基邻氨基苯甲酸3,4-二加氧酶(3-HAO)、波形蛋白(Vim)和脑源性神经营养因子(BDNF),以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为内参,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各个基因的相对转录水平.结果 感染组和对照组小鼠脑转录组的DEG共2 295个,其中上调2016个,下调279个.GO分析结果显示,生物过程中富集最显著的是定位,共257个DEG;细胞组分中富集最显著的是蛋白复合物,共425个DEG;分子功能中富集最显著的是分子转导活性,共177个DEG.生物过程、细胞组分和分子功能富集DEG数量最多的分别是细胞过程、细胞组分和结合,分别有1 039、1 240、1 088个DEG.KEGG分析结果显示,功能注释分析上调居前3位的代谢通路分别为免疫系统、信号转导、病毒性传染病,下调居前3位的分别为信号转导、信号分子和相互作用、免疫系统;功能富集分析结果显示77条通路富集显著.与抑郁症相关的信号通路有肿瘤坏死因子、神经活性配体-受体相互作用、NF-kappa B、JAK-STAT、坏死性凋亡、细胞凋亡、趋化因子、KYN通路等.qRT-PCR结果显示,以对照组小鼠相对转录水平为100％,感染组小鼠IFN-γ、IDO1、IDO2、KYNU、KMO、3-HAO 和 Vim 等 7 个基因的相对转录水平分别为 3 023.08％、355.52％、190.17％、496.55％、339.92％、212.74％、507.34％,较对照组的转录水平显著上调(t=3.782、3.749、3.226、2.908、2.533、5.656、2.948,均P＜0.05或0.01);BDNF的相对转录水平为63.32％,转录水平显著下调(t=2.398,P＜0.05).IFN-γ、IDO1、IDO2、KYNU、KMO、3-HAO、BDNF、Vim等 8 个基因 qRT-PCR获得的差异倍数分别为4.96、1.74、0.89、2.10、1.60、1.06、-0.94、2.18,转录组测序获得的差异倍数分别为7.30、0.55、0.80、3.83、2.75、3.53、-0.86、1.93.qRT-PCR与转录组测序获得的转录趋势一致.结论 筛选获得刚地弓形虫慢性感染小鼠脑转录组DEG,弓形虫慢性感染小鼠中枢神经系统免疫持续激活,与抑郁症相关的KYN通路的7个DEG的转录水平上调.

为了建立肉制品中猪源性成分检测的PCR方法,以猪线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cytb)为目的基因,设计猪特异性PCR引物;以猪、牛、羊、鸡及鸭DNA和不同稀释浓度猪DNA进行Real-time PCR反应,证明了该引物扩增具有物种特异性,检测低限可达5×10-5 ng/μL;设计内参基因-actin通用引物,以猪源性成分含量0％～100％的混合肉样DNA为模板扩增,建立标准曲线,2-△△Ct值与猪源性成分含量有良好线性关系(R2=0.991 4);对猪源性成分含量0％～75％的混合肉样检测,回收率为99.85％～102.60％.应用建立的PCR方法检测了市售的6种品牌火腿肠,标识为清真食品的5种均未检测到猪源性成分,未标识清真食品的猪源性成分含量为12.70％.建立的实时荧光PCR检测方法操作简便、特异性强、所得数据可靠,为肉制品猪源性成分检测提供了新的手段.