目的:探讨肌肽对小鼠卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响。方法:获取小鼠卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COC），分别用含10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L肌肽的体外成熟培养液培养18 h，不含肌肽的培养液设为对照组。根据卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚形成率确定作用的最优浓度。通过检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、总谷胱甘肽（total glutathione，T-GSH）含量、皮质颗粒分布、线粒体分布和线粒体拷贝数进一步验证肌肽的作用。结果:肌肽浓度为100 μmol/L时，卵母细胞成熟率［69.23%（135/195）］、卵裂率［66.06%（72/109）］和囊胚形成率［48.61%（35/72）］最高，与对照组［44.44%（84/189）、38.67%（29/75）、20.69%（6/29）］相比，差异具有统计学意义（ P<0.001、 P<0.001 、P=0.010），故选定100 μmol/L作为肌肽作用的最优浓度。对照组卵母细胞中的ROS和T-GSH水平为100 μmol/L肌肽组的2.04倍和0.64倍，差异具有统计学意义（均 P<0.001）。100 μmol/L肌肽组的皮质颗粒Ⅲ级的比例显著高于对照组（ P<0.001）。对照组卵母细胞的线粒体均匀分布在胞质中，100 μmol/L肌肽组的线粒体聚集在胞质中央区域，且荧光强度高于对照组（ P=0.040）。100 μmol/L肌肽组的线粒体拷贝数是对照组的1.72倍，差异具有统计学意义（ P<0.001）。 结论:肌肽能够有效改善未成熟卵母细胞的氧化应激，促进小鼠卵母细胞的体外成熟和胚胎发育。

目的:探讨青春期前重度β-地中海贫血（thalassemia major，TM）患者进行生育力保存的方法，为青春期前血液疾病患者进行生育力保存提供进一步的数据支持。方法:对1例青春期前拟行造血干细胞移植的TM患者通过卵巢组织冷冻（ovarian tissue cryopreservation，OTC）合并卵子体外成熟（ in vitro maturation，IVM）行生育力保存进行病例报道，结合文献阐述青春期前地中海贫血患者进行生育力保存的时机、指征及策略。 结果:患者卵巢组织获取术后，体外穿刺抽吸共获取24枚卵丘-颗粒细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs）及11片卵巢组织皮片。COCs经48 h IVM后共有9枚M Ⅱ期卵子行玻璃化冷冻。 结论:对亟待造血干细胞移植的青春期前女童，OTC结合卵母细胞IVM技术能在短期内最大程度地保存TM患者的生育力，提高其生育力保存的治疗效果。

目的 观察经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)及卵丘细胞(CCs)中生长分化因子9(GDF9)及Bim表达的影响,探讨其治疗效果及作用机制.方法 制备大鼠超排卵卵巢模型,收集COCs和CCs,分别与雌性SD超排卵大鼠空白血清和经后增殖方药物血清在体外共同培养,各分3组:空白血清组(空白组)、含药血清组(对照组)、含药血清+ GDF9受体阻断剂组(实验组),共6组.24 h后收集COCs和CCs,实时荧光定量PCR检测GDF9和Bim mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测GDF9蛋白表达水平.结果 (1)对照组COCs中GDF9 mRNA表达水平明显高于空白组和实验组(P＜0.05);对照组和实验组COCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P＜0.05);对照组COCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组(P＜0.05),亦高于实验组,但差异无统计学意义(P＞0.05).(2)CCs中GDF9 mRNA表达水平在3组间的差异性比较结果与COCs中一致;对照组和实验组CCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P＜0.05);对照组CCs中Bim mRNA表达水平明显低于实验组(P＜0.05);对照组CCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组和实验组(P＜0.05).(3)对照组COCs中GDF9 mRNA表达水平明显高于CCs中(P＜0.05),其余组内COSs和CCs比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经后增殖方舍药血清能提高COCs和CCs中GDF9的表达水平,维持COCs和CCs中Bim的低水平表达,抑制细胞凋亡,促进卵泡发育;COCs较剔除卵母细胞的CCs更有利于GDF9 mRNA的表达.

目的 探讨卵丘颗粒细胞复合体在卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)治疗周期中人类未成熟卵母细胞体外成熟和胚胎发育中的作用.方法 收集156例不孕不育患者行ICSI治疗周期中获得的305枚未成熟卵[M Ⅰ期(A):186枚;GV期(B):119枚],随机分为加颗粒细胞组(A1组、B1组)和对照组(A2组、B2组),体外培养24-48h后比较不同时间段两组的成熟情况、受精后胚胎的发育情况以及培养液中雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌水平.结果 加入颗粒细胞复合体共培养24-48h后,A1组24h成熟率和48h总成熟率高于A2组(P＜0.05&P＜0.05),B1组25-48h新增成熟率和48h总成熟率显著高于B2组(P＜0.01&P＜0.01),成熟后正常受精率、卵裂率、囊胚形成率组间比较均无统计学差异,但是A1组的优质胚胎率高于A2组(P＜0.05);加颗粒细胞组的培养液中E2水平明显高于对照组(P＜0.01).结论 与卵丘颗粒细胞复合体共培养可以提高ICSI治疗周期中所获未成熟卵的体外成熟率且MI期来源的成熟卵母细胞可以获得更高的优质胚胎率.

目的 本研究探讨腐胺是否通过抗氧化应激的机制提高体外培养的高龄卵母细胞的质量. 方法 从9月龄C56/B6J雌鼠获取GV期卵丘-卵母复合体(COC),分为对照组、0.5 mmol/L腐胺处理组、0.5 mmol/L α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO,腐胺抑制剂)组.三组COC体外培养液16～18 h,收集MⅡ期卵母细胞.计算各组高龄卵母细胞成熟率,检测卵母细胞mtDNA拷贝数,JC-1荧光分析染色线粒体膜电位,并分析卵母细胞内氧自由基和超氧化物歧化酶1(SOD1)的表达.结果 腐胺组卵母细胞成熟率显著高于对照组[(87.57±1.70)％ vs.(66.02±4.05)％,P＜0.01].DFMO处理组线粒体DNA拷贝数显著高于对照组(P＜0.05).与对照组相比,腐胺组卵母细胞内氧化应激水平显著下降(P＜0.01);DFMO组氧化应激水平显著升高(P＜0.01).与对照组比较,腐胺组卵母细胞线粒体膜电位显著升高(P＜0.01),而DFMO组显著下降(P＜0.05).与对照组比较,腐胺组卵母细胞内SOD1蛋白表达显著增高(P＜0.05),DFMO组显著下降(P＜0.05). 结论 体外培养的高龄卵母细胞,腐胺通过抗氧化应激、改善线粒体功能提高卵母细胞质量和胚胎发育潜能,具有潜在的临床应用价值.

动物体内卵泡排卵前促黄体素(luteinizing hormone,LH)诱导了卵丘颗粒细胞扩散,并启动卵母细胞恢复减数分裂.普遍认为,卵泡壁层颗粒细胞表达LH受体,卵母细胞及其周围卵丘细胞不表达LH受体,LH通过作用于卵泡壁层颗粒细胞产生信号分子,这些信号分子作用于卵丘颗粒细胞介导了LH生物作用.然而,一直以来,关于排卵前介导LH作用而诱导卵母细胞成熟的机制一直存在争议.目前研究认为,LH作用于卵泡壁层颗粒细胞后产生了EGF类因子,并与颗粒细胞的受体结合,促进了卵母细胞的成熟和发育.由于体外成熟的卵丘卵母细胞复合体来源于生长卵泡,其卵丘颗粒细胞EGF类因子信号系统不完善,目前的体外成熟培养体系难以模拟卵泡内的生理环境,导致卵母细胞体外发育能力较差,限制了这些卵母细胞的利用效率.本文综述了颗粒细胞EGF类因子信号系统、EGF类因子在调控卵母细胞成熟中的作用及对卵母细胞发育能力的影响,为优化卵母细胞体外成熟培养体系,完善卵丘颗粒细胞的EGF类因子的信号系统,进而提高卵母细胞体外成熟效率提供理论依据.

目的:探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)促排卵中针对卵巢过度刺激综合征(OHSS)高危患者所采取的3种预防策略的有效性.方法:回顾性分析2015年1月至2016年7月在温州医科大学附属第一医院生殖医学中心行IVF促排卵57d后呈现卵巢高反应的OHSS高危患者178例的临床资料,根据所采用的干预策略不同分为3组.A组(低剂量HCG扳机组,n=95):继续给予促排卵用药,密切超声监测卵泡发育,直至卵泡成熟,给予较低剂量的HCG扳机;B组(小卵泡抽吸减灭组,n=23):超声引导下经阴道穿刺术减灭直径≤12mm的卵泡,之后继续促排卵用药至HCG扳机;C组(未成熟卵体外培养IVM组,n=60):停止继续促排卵用药,超声引导下经阴道穿刺术抽吸所有可见小卵泡,将卵泡液中卵丘-卵母细胞复合体分离后进行体外培养成熟.比较各组实验室结果、临床妊娠结局和OHSS发生率.结果:3组优质胚胎率、移植周期临床妊娠率以及活婴分娩率差异无统计学意义(P＞0.05).3组均无重度OHSS发生.轻、中度OHSS的发生率A组为50.53％,B组为34.78％,均显著高于C组(0％)(P＜0.05),A组和B组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:对于IVF-ET促排卵中OHSS高危患者,采用低剂量HCG扳机、小卵泡抽吸减灭和未成熟卵体外培养均能完全避免发生重度OHSS,有效减少轻、中度OHSS的发生,同时3种干预策略都能带来较理想的妊娠结局.

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是一条从酵母到人中都高度保守的信号转导途径,广泛地存在于各种真核细胞中.近30多年来的研究表明,在几乎所有物种的雌性生殖细胞发育和减数分裂成熟过程中,该信号通路都发挥着至关重要的作用.特别是在包括人、小鼠和家畜的哺乳动物中,MAPK信号通路在卵母细胞恢复减数第一次分裂过程中被激活,调控纺锤体组装和细胞周期进程,并在颗粒细胞中介导促性腺激素的生理作用,促进卵丘扩展、排卵和黄体形成.虽然MAPK信号通路在雌性生殖过程中发挥着如此广泛的生理功能,并且这些功能在进化过程中高度保守,但是对于其作用机制,特别是其直接作用靶分子,在很长一段时间没有被充分研究清楚.近些年,基于一些新的基因编辑小鼠模型和理论研究成果,以及各种组学技术的广泛应用,人们进一步揭示了MAPK在减数分裂恢复过程中直接磷酸化激活RNA结合蛋白——胞质聚腺苷酸化原件结合蛋白l(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein-1,CPEBl),促进母源mRNA的poly(A)尾延伸,介导蛋白翻译激活.这些研究结果不但构成了目前本领域哺乳动物卵母细胞成熟和排卵机制的基本理论,也对本领域其他相关研究提供了可借鉴的研究思路.结合本研究组和其他科学家近年来的系统研究工作,我们对MAPK与卵母细胞成熟和排卵的研究进行了历史回顾,介绍了当前研究进展,提出了新近出现但尚未解决的科学问题,包括MAPK在颗粒细胞中对mRNA翻译和降解的调控,以及对翻译起始复合体、mRNA加尾酶的直接磷酸化激活等.

目的 组蛋白磷酸化修饰在卵母细胞减数分裂过程中作用机制的研究较少.文中旨在探讨猪卵母细胞中组蛋白H3的磷酸化模式及对卵母细胞减数分裂过程的调控.方法 首先采用免疫组化法鉴定组蛋白H3Ser10(H 3S10)磷酸化在猪卵母细胞减数分裂过程的表达情况,随后体外成熟猪卵母细胞,将卵丘卵母细胞复合体(COCs)分为4个组,一组正常培养作为对照组,另外3组分别添加5、10、30 μmol/L ZM447439的成熟液,体外培养27 h,分别为5、10、30 μmol/L ZM447439处理组.统计卵母细胞在减数分裂各个时期所占的比例,并进一步检测猪卵母细胞组蛋白H3S10磷酸化的表达模式及蛋白激酶Aurora B基因表达的情况.结果 与GVBD期组蛋白H3S10磷酸化水平比较,MI期和AI期明显升高(P<0.05),AI期较MⅡ期明显升高(P<0.05).与对照组相比,10、30 μmol/L ZM447439 处理组 GVBD 期卵母细胞比例[(32.14 ± 0.51)％、(95.34±0.59)％]较对照组[(2.56±0.03)％]增加(P<0.05),MI[(66.88±0.13)％、(4.66±0.04)％]较对照组[(87.42±0.14)％]明显下降(P<0.05)、AI期[(1.01±0.03)％、(0.00±0.00)％]较对照组[(10.02±0.21)％]明显下降(P<0.05).与对照组卵母细胞发生H3S10去磷酸化修饰比例(0)比较,10μmol/L 、30μmol/L ZM447439处理组[(35.2±0.39)％、(95.4±0.65)％]明显升高(P<0.05).与对照组相比,10、30μmol/L ZM447439处理组Aurora B基因的相对表达量显著降低(P<0.05).结论 组蛋白H3S10磷酸化修饰在哺乳动物卵母细胞成熟过程起着一定作用.Aurora B激酶抑制剂ZM447439处理引起组蛋白H3S10磷酸化水平及Aurora-B激酶的表达降低导致卵母细胞成熟障碍.

在马(Equus caballus)的繁殖和非繁殖季节,本研究探讨马扩展型(Ex)和紧凑型(Cp)卵丘-卵母细胞复合体(COCs)卵母细胞的孤雌激活效率.在繁殖季节,探讨马驹和成年马成纤维细胞核移植(SCNT)的成功率.孤雌激活实验结果显示,在繁殖季节,发育到2-细胞、4-细胞和桑椹胚的比例,扩展型(Ex)卵丘-卵母细胞复合体分别是52.8％ (19/36)、38.9％ (14/36)和5.6％ (2/36),紧凑型(Cp)卵丘-卵母细胞复合体分别是47.9％ (23/48)、33.3％ (16/48)和6.2％ (3/48).在非繁殖季节,发育到2-细胞、4-细胞的比例,扩展型(Ex)分别是37.2％ (16/43)和16.3％ (7/43),紧凑型(Cp)的比例分别是35.1％ (27/77)和11.7％ (9/77),都没有获得桑椹胚.同一季节,扩展型(Ex)与紧凑型(Cp)胚胎发育的比率差异不显著(P＞0.05),不同季节,两者差异显著(P＜0.05).体细胞核移植实验结果显示,以马驹成纤维细胞作为核供体细胞,胚胎发育到2-细胞、4～8细胞和桑椹胚的比例分别是41.5％(22/53)、33.9％ (18/53)和15.1％ (8/53),以成年马成纤维细胞作为核供体细胞,比例分别是38.9％(7/18)、22.2％ (4/18),没有获得桑椹胚.综上所述,季节和卵丘巧卵母细胞复合体(COCs)类型影响马卵母细胞孤雌激活的效率,不同核供体细胞影响克隆胚胎构建的成功率.