目的:初步探讨老年髓系肿瘤患者的分子遗传学特点。方法:采用高通量DNA测序技术检测26例急性髓系白血病(AML)及55例骨髓增生异常综合征(MDS)患者49种靶基因突变；采用基因组DNA-PCR联合Sanger测序法检测CALR基因9号外显子、NPM1基因12号外显子、FLT3-ITD及CEBPA的TAD、BZIP两个功能结构域的突变发生情况。结果:(1)77例患者中，总的基因突变发生率为91.0%，每例患者平均突变2次，其中≥3种基因突变共存发生率为42.9%；最常见的基因突变依次为：NPM1，U2AF1，RUNX1，TET2，ASXL1，TP53，DNMT3A，IDH2，BCOR，FLT3-ITD，其余基因突变发生率<10%。(2)双基因突变在AML中的发生率高于MDS组，≥3个基因突变在MDS组的发生率高于AML组( P＝0.003，0.011)。NPM1、FLT3-ITD、CEBPA双突变在AML中的发生率高于MDS患者，BCOR、ASXL1突变在MDS组发生率高于AML组( P<0.05)。功能归类后显示，酪氨酸激酶受体基因突变主要发生于AML组，而染色质修饰基因突变主要发生于MDS组，( P＝0.004，0.007)。(3)有效随访MDS患者51例，9例在随访过程中发生白血病转化，平均转化时间为6.5个月，其中，伴RUNX1、U2AF1突变者转白率为44.4%，高于其他基因突变。 结论:老年髓系肿瘤有独特的基因突变谱，常见髓系肿瘤基因突变类型及频率在AML及MDS中分布不同，MDS患者中部分基因突变与白血病转化有一定相关性。

目的:构建同时表达神经纤毛蛋白质1(NRP-1)和存活素(Survivin)双基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，通过体内外实验，观察其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响。方法:构建同时表达NRP-1和Survivin双基因的质粒(Plasmid-1)，并构建单独表达NRP-1和Survivin基因质粒(分别为Plasmid-2、Plasmid-3)。转染入鼻咽癌CNE-2Z细胞株，于荧光显微镜观察质粒转染及表达情况；以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(Western blot)在mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因抑制作用。建立稳定转染裸鼠移植瘤模型，体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果。原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析。结果:通过测序证实重组shRNA真核表达载体构建成功。各重组质粒表达载体成功转染CNE-2Z细胞，可见大量的癌细胞表达绿色荧光。MTT显示细胞增殖受到抑制，且双基因干扰质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因干扰质粒，差异有统计学意义(0.209±0.021比0.392±0.013、0.384±0.014， F＝354.121， P<0.05)。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实双基因联合沉默组和单基因沉默组均能有效抑制目的基因mRNA表达，双基因组NRP-1 mRNA(0.20±0.06)表达明显低于NRP-1单基因组(0.27±0.05)，差异有统计学意义( F＝198.437， P<0.05)；双基因组Survivin mRNA表达(0.13±0.02)明显低于Survivin单基因组(0.17±0.01)，差异有统计学意义( F＝245.647， P<0.05)。Western blot检测结果双基因组对NRP-1和Survivin蛋白的表达抑制率分别为67.41%和79.24%，与单基因组比较均有统计学意义( F＝129.354、216.411， P<0.05)。体内抑瘤实验证实，与NRP-1单基因干扰组[(0.628±0.013) cm 3]、Survivin单基因干扰组[(0.601±0.301) cm 3]比较，双基因干扰组[(0.205±0.002) cm 3]瘤体积生长明显受到抑制，差异有统计学意义( F＝49.214， P<0.05)，抑瘤率为81.71%。TUNEL实验表明双基因干扰组凋亡指数[(49.84±1.98)%]，显著高于NRP-1单基因组[(21.53±2.01)%， P<0.05]和Survivin单基因组[(19.91±2.11)%]，差异有统计学意义( F＝254.130， P<0.05)。 结论:同时表达两个不同基因的shRNA质粒载体转染鼻咽癌细胞后，可同时敲降NRP-1和survivin基因表达，与单个基因沉默比较，可以更好的促进细胞凋亡，抑制细胞生长增殖。

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)-12基因序贯转染兔脂肪干细胞向成纤维细胞分化的可能性。方法:2017年1月至2018年12月，原代培养兔脂肪干细胞(取自新西兰大耳兔颈背部皮下脂肪)，细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106检测结合成骨细胞诱导分化对培养的细胞进行鉴定，脂质体介导的方法序贯转染BMP-12和bFGF基因，蛋白质印迹法(Western blot)检测目的基因BMP-12和bFGF蛋白的表达；实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测转染细胞Ⅰ型胶原和弹性蛋白RNA的表达情况。符合正态分布的计量资料以均数±标准差( ± s)表示，应用单因素方差分析比较组间差异。 结果:兔脂肪组织中分离出来的脂肪间充质干细胞(ADSCs) CD44、CD49d表达阳性，CD106表达呈阴性。Western blot检测筛选后的ADSCs稳定表达BMP-12(0.229±0.005)和bFGF(0.208±0.019)蛋白( F＝120.221， P<0.05)，差异有统计学意义。双基因转染的ADSCsⅠ型胶原(2.250±0.007， F＝340.103， P<0.05)和弹性蛋白(1.807±0.008， F＝107.314， P<0.05)的mRNA表达最高，差异均有统计学意义。 结论:pcDNA3.1＋绿色荧光蛋白(GFP)-BMP-12和pcDNA3.1＋红色荧光蛋白(RFP)-bFGF可以促进ADSCs向成纤维细胞分化，可能在组织工程技术修复韧带损伤中具有重要作用。

目的:探讨1个先天性重度耳聋家系的致病基因变异类型，明确其可能的遗传学病因。方法:运用高通量测序的方法对家系中的先证者进行415个遗传性耳聋相关基因的序列检测，应用Sanger测序法对高通量测序结果进行验证并对先证者父母和妹妹进行基因变异位点验证。结果:先证者基因组DNA中检测到与双基因Usher综合征1D/F型耳聋相关的 CDH23基因c.5131G>A(p.Val1711Ile)杂合变异和 PCDH15基因c.2884C>T(p.Arg962Cys)杂合变异，先证者父亲携带 PCDH15基因c.2884C>T(p.Arg962Cys)杂合变异，先证者母亲携带 CDH23基因c.5131G>A(p.Val1711Ile)杂合变异。先证者妹妹听力正常，携带 CDH23基因c.5131G>A(p.Val1711Ile)杂合变异，不携带 PCDH15基因c.2884C>T(p.Arg962Cys)杂合变异。按照美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南进行致病性评级， CDH23基因c.5131G>A(p.Val1711Ile)变异和 PCDH15基因c.2884C>T(p.Arg962Cys)变异均为可能致病性变异(PS1+PM2+PP3+PP4)。 结论:CDH23基因c.5131G>A(p.Val1711Ile)变异和 PCDH15基因c.2884C>T(p.Arg962Cys)变异可能为该家系耳聋发生的遗传学原因。

为探讨新型生物标本口腔液在新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸和抗体检测中的应用价值，采集2021年10—11月北京两起新型冠状病毒肺炎（简称“新冠肺炎”）聚集性疫情的7例确诊病例的口腔液及配对的呼吸道和血液样本。采用荧光定量PCR和血清抗体检测试剂盒分别检测SARS-CoV-2核酸和IgG抗体，同时采用新建的磁微粒化学发光法检测口腔液标本SARS-CoV-2 IgG抗体。结果显示，3例新冠肺炎确诊病例鼻咽拭子、咽拭子和口腔液标本SARS-CoV-2核酸检测结果均为阳性，其中2例病例口腔液双基因循环阈值（ Ct值）与咽拭子相近，1例高于咽拭子。获得1例确诊病例口腔液标本全基因组序列，属于VOC/Delta变异株。口腔液和配对血清标本SARS-CoV-2 IgG抗体均为阳性，口腔液的S/CO值较血清低。其中，采集到口腔液系列标本的病例，口腔液抗体水平在发病后11~32 d呈上升趋势。

目的:探讨北京地区2020年疫情防控措施下急性胃肠炎患儿诺如病毒的分子流行病学特点。方法:采用回顾性重复横断面研究方法，2020年收集首都儿科研究所附属儿童医院就诊急性胃肠炎患儿的粪便标本或呕吐物标本1 213份。首先用实时荧光反转录PCR进行标本中诺如病毒筛查，然后用反转录PCR对诺如病毒阳性标本进行病毒VP1基因和RdRp基因扩增，据核苷酸序列进行基因分型。采用χ 2 检验对不同标本类型、患儿不同性别及不同年龄组间诺如病毒的检出阳性率进行比较。 结果:在1 213份急性胃肠炎患儿标本中，共筛查到诺如病毒阳性标本215份，全年的检出阳性率为17.7%，阳性病例集中在秋冬季节［1、10、11及12月阳性率分别为28.6%（18/63）、26.2%（16/61）、22.8%（77/338）以及17.1%（89/520）］。粪便标本的阳性率明显高于呕吐物标本（χ2=9.692， P<0.01），而男女性别差异无统计学意义（χ2=0.041， P>0.05），各年龄组间诺如病毒检出率差异有统计学意义（χ2=103.112， P<0.01），以6~48月龄诺如病毒的检出率较高。对G基因型分析显示共有3个基因群（GⅠ、GⅡ和GⅨ）诺如病毒流行，以GⅡ基因群为主，占总数的98.5%（196/199）。而GⅡ基因群中以GⅡ.4 Sydney为主要流行株，占GⅡ基因群的55.1%（108/196）；其次为GⅡ.2型（29.6%，58/196），以往流行的GⅡ.3型（10.2%，20/196）诺如病毒在本次监测周期中较少。诺如病毒P基因型分析结果显示以GⅡ.P16为主，占61.5%（96/156）；其次为GⅡ.P31（19.9%，31/156）。双基因测定结果显示以GⅡ.4 Sydney［P16］为主，占36.4%（56/154），其次为GⅡ.2［P16］ 占24.7%（38/154）。 结论:2020年诺如病毒的总阳性率与以往没有大的区别，但流行的基因型别构成有了明显的改变，且呈现多种基因型别诺如病毒的同时流行。

目的 分析曲靖地区新生儿常见耳聋基因突变类型、携带率及突变位点的分布特征,为耳聋出生缺陷防控提供依据.方法 采集2018年4月—2020年12月在曲靖市第一人民医院出生的7 246例新生儿的脐带血,提取DNA并采用PCR+导流杂交技术检测 4 种耳聋基因 13 个位点包括 GJB2 基因(c.35delG、c.176de116、c.235delC、c.299delAT、c.155delTCTG)、SLC26A4 基因(c.IVS7-2A＞G、c.2168A＞G、c.1229C＞T)、线粒体 DNA(12SrRNA:m.1494C＞T、m.1555A＞G;tRNA:m.7445A＞G、m.12201 C＞T)、GJB3基因(c.538C＞T).检出的耳聋基因纯合突变、均质突变及罕见突变采用Sangar测序再次进行验证.结果 在7 246例新生儿中,共检出耳聋基因突变267例,突变率为3.68％.耳聋基因在男婴中突变例数124例,突变率为3.24％(124/3 822),在女婴中的突变例数143例,突变率为4.18％(143/3 424),男婴、女婴的突变率比较,差异有统计学意义(x2=4.42,P＜0.05).GJB2基因突变152例,突变率为2.10％,其中c.235delC位点突变124例(1.71％);SLC26A4基因突变58例,突变率为0.80％;线粒体DNA突变30例,突变率为0.41％;GJB3基因突变20例,突变率为0.28％;双基因突变有7例.在267例耳聋基因突变携带者中,29例新生儿听力初筛未通过,3个月后随访,听力复筛均通过.3例线粒体12SrRNA基因m.1555A＞G均质突变患者存在家族遗传史,其中1例家族中有多个耳聋患者.结论 开展新生儿耳聋基因筛查有助于了解曲靖地区耳聋突变基因的携带情况,及早发现先天性耳聋患者,高度预警药物性耳聋和迟发性耳聋,对降低耳聋发生率具有重要作用.

目的 通过慢病毒载体将NEP1-40 (Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子3 (neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSCs)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSCs的可行性,为NSCs体内实验奠定基础.方法 将SD大鼠胚胎室管膜区NSCs采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组).用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间.再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达.结果 荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSCs内转染率最高,最佳时间为转染48 h时.实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P＜0.05);A、C组间及B、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).C、D组NT-3 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P＜0.05);A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSCs内,在NSCs内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用.

目的 构建Ⅱ型猪链球菌05ZYH33菌株双组分系统Ihk/Irr的双基因缺失突变株.方法 首先对双组分系统 Ihk/Irr基因进行序列分析;选取Ihk/Irr基因的相关片段克隆至pET30a表达载体,进行可溶表达并注射家兔制备抗体;分别将ihk基因上游irr基因下游各1 kb的片段扩增,将两个片段连接起来;克隆至温敏型pJRS233的穿梭质粒中;利用两步同源重组法获得突变体;分别提取突变株的基因组DNA,RNA及菌体总蛋白,利用PCR, RT-PCR,Western-blot方法验证突变体.结果 成功制备了双组分系统Ihk/Irr可溶性表达的蛋白,成功构建了重组的温敏型ikr-pJRS233重组质粒,成功将重组质粒转入猪链球菌05ZYH33中并获得突变株,基因组PCR,RT-PCR及Western-blot分别证实了双组分系统Ihk/Irr双基因被成功敲除.结论 成功构建重组温敏型的穿梭质粒,导入到猪链球菌05ZYH33菌株中经两步同源重组获得突变株,在基因组DNA,RNA及蛋白水平上验证了双组分系统Ihk/Irr双基因缺失株的成功构建.

目的探讨粪便DNA中联合分泌型卷曲相关蛋白1(SFRPl)及胞裂蛋白9(SEPT9)基因甲基化检测对老年性结直肠癌(CRC)早期诊断的临床价值.方法选取我院从2016年1月至2016年9月确诊的35例年龄>60岁CRC患者为研究组,选取同期35例>60岁正常体检者为对照组.提取CRC患者和正常体检者粪便DNA,采用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测SFRP1及SEPT9基因的甲基化状态;比较CRC患者单基因和联合双基因甲基化检出率的差异,以及CRC患者联合双基因甲基化检出率与对照组的差异;分析CRC患者SFRP1或SEPT9基因甲基化与临床病理特征(如年龄、性别、肿瘤位置)的关系.结果CRC患者粪便DNA中SFRP1及SEPT9基因甲基化检出率分别为45.71％(16/35)和51.43％(18/35),均显著高于对照组的8.57％(3/35)和14.29％(5/35),差异均有统计学意义(P<0.01);联合双基因检测结果显示,82.86％(29/35)的CRC患者粪便DNA中至少存在一个基因的甲基化,显著高于单基因检出率(P<0.01),亦高于对照组的17.14％(6/35),差异有统计学意义(P<0.01).CRC患者SFRP1或SEPT9基因甲基化与年龄、性别、肿瘤位置均无关(P>0.05).结论粪便DNA中联合SFRP1及SEPT9基因甲基化检测比单基因检测更加敏感,对老年性CRC早期诊断具有重要的应用价值.