目的:分析糖尿病性认知功能障碍（DACD）大鼠脑白质差异蛋白质组学。方法:20只SD大鼠分为对照组（10只）和2型糖尿病（T2DM）组（10只），对照组喂养标准饲料，T2DM组利用高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲霉素建立T2DM模型。利用Morris水迷宫检测大鼠认知功能，使用弥散张量成像技术评价大鼠脑白质病变（WML）程度。通过蛋白质非标记定量技术（Label-free）进行脑白质差异蛋白质组学分析，对筛选出的差异蛋白质进行生物信息学分析，最后选取一些差异蛋白质进行Western blot验证。组间差异的比较采用独立样本 t检验或Wilcoxon检验。 结果:共筛选到38种差异蛋白质：24个蛋白表达上调（差异倍数>2.0且 P<0.05），14个蛋白表达下调（差异倍数<-2.0且 P<0.05）。差异蛋白质主要分布在细胞膜、细胞质、外泌体等，主要参与神经系统发育、负向调控神经细胞的凋亡以及化学突触传递等生物学过程。差异蛋白质主要富集在4个信号通路上，且以脑源性神经营养因子、一氧化氮合酶1、神经调节素（GAP43）、囊泡谷氨酸转运蛋白1（SLC17A7）、动力蛋白1、代谢型谷氨酸受体5和氨基酸转运蛋白等蛋白为核心骨架，形成蛋白相互作用信息网络。 结论:差异蛋白质同时参与认知功能障碍及WML相关的多条信号通路，GAP43和SLC17A7可能是WML发病机制的关键靶点。

目的:利用狂犬病病毒(RV)介导的逆行跨单级突触追踪技术,观察丘脑背内侧核(MD)内囊泡膜谷氨酸转运体2(VGLUT2)阳性神经元的全脑突触前神经元分布.方法:将RV的辅助病毒注射至VGLUT2-ires-Cre转基因小鼠右侧MD,两周后将RV注入相同区域.一周后灌注取材,进行全脑扫描,观察RV标记的突触前神经元在全脑的分布.结果:将RV病毒注入VGLUT2-ires-Cre小鼠MD后,在皮质和脑干内可观察到密集的突触前神经元.皮质内逆标神经元多分布于运动皮质、内侧前额叶皮质、眶额皮质和岛叶;丘脑内多见于丘脑网状核和下丘脑外侧区等;而脑干逆标神经元则主要分布在臂旁外侧核、中脑导水管周围灰质和中缝核等部位.结论:MD内VGLUT2阳性神经元一方面可接受来自脑干的上行纤维的投射,或丘脑网状核的信息调控;另一方面作为高阶丘脑也可接受皮质的下行投射,参与脑内的多种功能.以上结果为研究MD的功能及相关神经环路的机制提供了形态学基础.

目的:建立新生小鼠缺氧模型,观察缺氧后大脑中认知相关脑区主要神经细胞类型在发育期的变化特征.方法:新生2 d的仔鼠在10％氧环境连续饲养5 d,之后放回正常氧环境,并在发育阶段不同时间点取材.利用免疫荧光组织化学比较小鼠缺氧后胼胝体(CC)和运动皮质(M1)中少突胶质细胞密度、成熟少突胶质细胞的比率、髓鞘蛋白水平的变化,以及前扣带回皮质(ACC)、海马(Hippo)、感觉皮质(S1)中兴奋性神经元、抑制性神经元的表达变化.进一步比较ACC中不同类型抑制性中间神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞的密度变化特征.同时,还检测了缺氧对突触蛋白表达的影响.结果:免疫荧光定量检测结果显示:与对照组相比,缺氧小鼠CC、M1中髓鞘蛋白表达水平,成熟少突胶质细胞的比率均降低;ACC中兴奋性神经元的数量无显著差异,而ACC、Hippo以及S1的γ-氨基丁酸(GABA)标记的抑制性神经元的数量显著降低;ACC中小清蛋白阳性(PV+)神经元、生长抑素阳性(SST+)神经元和血管活性肠多肽阳性(VIP+)神经元的数量均显著减少;缺氧小鼠ACC中囊泡膜谷氨酸转运体1(VGluT1)标记的兴奋性突触点的数量和桥尾蛋白(gephyrin)标记的抑制性突触点的数量均显著减少.虽然星形胶质细胞和小胶质细胞的数量无显著差异,但缺氧损伤以后小胶质细胞被激活.结论:慢性缺氧将导致发育期小鼠出现以少突胶质细胞和中间神经元发育受阻,以及突触形成障碍为主要特征的改变.这些结果为探索脑智发育异常相关疾病的神经机制提供了重要实验依据.

目的:利用囊泡膜谷氨酸转运体2(VGluT2)-ires-cre、谷氨酸脱羧酶2(GAD2)-ires-cre和羟色胺转运体(Sert)-ires-cre小鼠结合重组狂犬病毒介导的逆行跨单级突触追踪技术,研究未定带(ZI)和中脑导水管周围灰质腹外侧区(vlPAG)内特异性神经元之间的纤维联系.方法:首先将辅助病毒注入转基因小鼠右侧vlPAG内,两周过后将重组狂犬病毒(RV)注入相同区域.一周后,在激光共聚焦显微镜下观察RV标记的突触前神经元在ZI内的分布.结果:将RV注入vlPAG后,在VGluT2-ires-cre小鼠ZI的吻尾方向上均可观察到逆标的突触前神经元分布;GAD2-ires-cre小鼠逆标神经元只见于ZI吻侧部,但Sert-ires-cre小鼠ZI内少见RV逆行标记的突触前神经元.结论:ZI神经元发出投射至vlPAG,作用于其中的谷氨酸能神经元或GABA能神经元,该通路可能参与了疼痛或恐惧样行为的调控.

目的 观察慢性束缚应激后,小鼠清醒状态下咬肌肌电水平以及支配咬肌运动的三叉神经运动核(trigeminal motor nucleus,Vmo)神经元的变化,为探究心理因素与颞下颌关节紊乱病发生的相关中枢调控机制提供实验依据.方法 32 只雄性小鼠被随机分为对照组、应激组,对应激组小鼠施加 4h/d、连续 14d的慢性束缚应激;对照组小鼠正常饲养.14 d后,通过旷场实验与高架十字迷宫实验观察小鼠的行为学改变;检测清醒状态下小鼠咬肌肌电水平;采用全细胞膜片钳技术观察Vmo神经元的电生理特性,并利用免疫组织荧光技术观察Vmo内Ⅰ型、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 1/2,VGLUT1/2)的表达情况.结果 应激组小鼠在旷场实验的中央活动时间(P=0.0004)与中央活动路程(P=0.0004)均显著低于对照组;高架十字迷宫实验中应激组小鼠的开臂进入次数百分比(P=0.0002)与滞留开臂时间百分比(P=0.0013)均显著低于对照组,显示存在明显的焦虑样行为.对照组和应激组小鼠在应激开始前,咬肌累积肌电(integral electromyography,iEMG)(P=0.8779)及振幅均方根(root mean square,RMS)(P＞0.9999)均无明显差异;应激结束后,应激组小鼠咬肌的iEMG(P=0.0004)和 RMS 值(P= 0.0001)均显著高于对照组.对照组小鼠在应激前后的 iEMG(P= 0.7989)和 RMS 值(P＞0.9999)比较无显著差异;应激组小鼠在应激结束后,其咬肌的iEMG(P=0.0011)和RMS值(P=0.0019)显著高于应激前水平.电生理结果显示,在电流钳模式下,当输入 60、80、100 pA电流时,应激组小鼠Vmo神经元的放电频率显著高于对照组(P＜0.05);应激组小鼠Vmo神经元的自发性兴奋性突触后电流频率(P=0.0030)与幅度(P=0.0002)显著高于对照组.免疫组织荧光染色结果显示,应激组小鼠Vmo部位的VGLUT1(P=0.0010)与VGLUT2 荧光强度(P=0.0013)均显著高于对照组.结论 慢性束缚应激能够导致小鼠的焦虑样行为及咬肌肌电活动水平的增高.应激后脑内Vmo神经元兴奋性升高,其受到的谷氨酸能兴奋性投射增多,可能是束缚应激造成咬肌肌电活动水平升高的中枢机制之一.

目的 探讨囊泡膜谷氨酸转运体1(VGLUT1) 和VGLUT2阳性纤维和终末在生后第0天(P0) 至第22天(P22) 大鼠脊髓内的分布情况和表达变化.方法 对生后发育P0～P22大鼠的颈膨大和腰膨大部位,进行VGLUT1和VGLUT2免疫组织化学染色.结果 P0 ～ P22大鼠颈膨大和腰膨大脊髓内均可观察到VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末,但未观察到胞体样结构.VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末的分布呈现明显的互补分布,尤其是以脊髓后角更加明显.其中,VGLUT1阳性纤维和终末在P0主要见于颈膨大和腰膨大脊髓后角Ⅲ ～Ⅴ层,中间部和前角很微弱.脊髓发育至P3,不仅Ⅲ ～Ⅴ层VGLUT1的表达进一步增强,且向外侧部扩展,并在后角基底部Ⅵ层和前角的外侧部(Ⅸ层) 也可观察到较强的VGLUT1阳性纤维,呈现一条明显由背内向腹外的带状分布趋势.P7时此带状分布更加明显,并随着发育逐渐向内、外扩展,至P22时已广泛分布于除Ⅱ层之外的整个脊髓.而VGLUT2阳性纤维和终末在P0时即密集出现于脊髓后角Ⅰ ～ Ⅱ层以及前角的外侧边缘区域;之后随着发育,VGLUT2阳性纤维和终末的分布模式并未发生明显改变,但其密度逐渐有所增加,特别是Ⅰ ～ Ⅱ层内VGLUT2阳性产物的表达尤为明显.另外,在脊髓白质后索内可见VGLUT1阳性皮质脊髓后束纤维由颈髓(P3) 逐渐下降至腰髓(P7) 的发育过程.结论 VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末在脊髓发育过程中呈现明显不同,且表现出互补分布的特点,这对于进一步理解VGLUT1和VGLUT2在脊髓生后发育过程中不同功能特点可能有意义.

目的:在vGluT2-ires-cre小鼠脑中利用重组狂犬病毒介导的逆行跨单级突触追踪和免疫荧光组织化学染色技术,研究蓝斑(LC)和中脑导水管周围灰质腹外侧区(vlPAG)之间的纤维联系.方法:首先将辅助病毒注入vGluT2-ires-cre小鼠右侧vlPAG内,三周过后将重组狂犬病毒注入相同区域.一周后,在激光共聚焦显微镜下观察全脑突触前神经元的分布;同时利用免疫荧光组织化学技术,特异性标记LC内去甲肾上腺素能神经元,观察LC内去甲肾上腺素能神经元与狂犬病毒逆行标记的神经元之间的共存情况.结果:将狂犬病毒介导的逆行跨单级突触病毒注入vlPAG后,脑内大量的核团,如背内侧前额叶皮质(dmPFC)、前扣带回皮质(ACC)、LC等,均可观察到大量密集分布的突触前神经元.利用免疫荧光组织化学双重染色技术,观察到LC内存在密集分布的TH样免疫阳性神经元,且部分TH阳性神经元同时与狂犬病毒标记的神经元共标,证实LC和vlPAG之间存在纤维联系.结论:LC内去甲肾上腺素能神经元发出投射至vlPAG,作用于其中的谷氨酸能神经元,该通路可能参与了镇痛效应以及慢性痛状态下觉醒的维持.

目的 评价脉冲射频对糖尿病神经痛大鼠腰交感神经节表型转化的影响.方法 清洁级健康成年雄性SD大鼠24只,2月龄,体重180～220 g,采用随机数字表法分为4组(n=6):对照组(C组)、糖尿病神经痛组(PDN组)、脉冲射频组(PRF组)和脉冲射频对照组(PC组).采用腹腔注射链脲佐菌素60 mg/kg的方法制备大鼠糖尿病神经痛模型,C组腹腔注射枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液6 ml/kg,PC组只进行射频针穿刺,PRF组对右侧L3椎旁的腰交感神经节行脉冲射频.于腹腔注射前(T0)、脉冲射频前(T1)、脉冲射频后1、3、5、7和14 d(T2-6)时测定机械缩足反应阈(MWT),随后处死大鼠取术侧L3交感神经节,采用免疫荧光双标法检测酪氨酸羟化酶(TH)和囊泡膜谷氨酸转运体2(VGLUT2)的表达,光镜下观察病理学结果,计数表达VGLUT2的神经元数量.结果 与C组比较,PDN组、PC组和PRF组T1-6时MWT降低,T6时表达VGLUT2神经元数量增加(P＜0.05);与PDN组和PC组比较,PRF组T2-6时MWT升高,T6时表达VGLUT2神经元数量减少(P＜0.05).C组腰交感神经节见TH表达,未见VGLUT表达;其余3组腰交感神经节见TH和VGLUT2表达,尤其以PDN组和PC组明显;多数表达VGLUT2神经元同时可见TH表达.结论 脉冲射频减轻大鼠糖尿病神经痛的机制与抑制腰交感神经节表型转化有关.

目的:观察小柴胡汤加味对慢性束缚抑郁模型大鼠海马谷氨酸膜转运体(EAATs)及囊泡转运体(VGLUTs)表达的影响,探讨小柴胡汤加味基于谷氨酸转运的抗抑郁机制.方法:120只SD大鼠随机分为正常组、模型组、小柴胡汤加味组低、中、高剂量组、利鲁唑组,每组20只.除正常组外,其余各组采用束缚应激制备大鼠抑郁模型,小柴胡汤加味低、中、高剂量组分别灌胃(ig)小柴胡汤加味6.5,13,26 g·kg-1;利鲁唑组腹腔注射利鲁唑20 mg· kg-1;正常组和模型组i等量生理盐水;1次/d,共干预21d.采用强迫游泳实验(FST)和悬尾实验(TST)评价大鼠的抑郁行为;采用高效液相色谱法(HPLC)检测海马组织中谷氨酸含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠海马中EAAT1,EAAT2和EAAT3 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织EAAT1,EAAT2,EAAT3,VGLUT1,VGLUT2蛋白表达;用尼氏染色法观察大鼠海马神经元形态,免疫组化(IHC)检测海马CA1区EAAT1,EAAT2和NeuN蛋白在神经细胞中的定位表达.结果:与正常组比较,模型组大鼠悬尾和强迫游泳不动时间均显著延长(P＜0.01),海马内EAAT1,EAAT2,EAAT3 mRNA和蛋白表达均显著下降(P＜0.01),VGLUT1和NeuN蛋白表达均显著降低(P＜0.01);而谷氨酸水平和VGLUT2表达均显著增高(P＜0.01).与模型组比较,小柴胡汤加味中、高剂量组大鼠悬尾和强迫游泳不动时间明显缩短(P＜0.05,P＜0.01),海马内EAAT1,EAAT2和EAAT3mRNA和蛋白表达量均显著增加(P＜0.01),VGLUT1和NeuN蛋白表达均显著增强(P＜0.01),谷氨酸水平和VGLUT2表达显著回降(P＜0.01),海马神经元结构明显复原.结论:小柴胡汤加味有明显的抗抑郁作用,其机制可能与其上调大鼠海马内EAAT1,EAAT2,EAAT3基因和VGLUT1蛋白表达.

目的:异常咬合信息可以通过牙周本体感受器、三叉神经系向高级中枢传递,三叉神经感觉主核背内侧部(dorsomedial part of the trigeminal nucleus,Vpdm)-丘脑腹后内侧核(ventral posteromedial thalamic nucleus,VPM)是重要的三叉神经系上传通路,Vpdm是否会受到异常咬合影响,是否继续上传至VPM值得深入研究.本文通过检测单侧前牙反(牙合)(unilateral anterior crossbite,UAC)大鼠,Vpdm及VPM中兴奋性神经传导标志物—囊泡膜谷氨酸转运体1,2(vesicular glutamate transporterl,2,VGLUT1,2)的表达变化,探讨该问题.方法:将雌性大鼠42只分为UAC组和对照组,造模后2、4和8周取材,以免疫荧光、Western blot及实时定量PCR技术,检测目标神经核团中VGLUT1,2的表达差异.结果:UAC组Vpdm内VGLUT1蛋白和mRNA的表达在各个时间点均明显高于对照组,而VGLUT2mRNA的表达则无显著性差异.在VPM内,VGLUT1,2的蛋白水平和mRNA水平两组间均无显著差异.结论:UAC促进了Vpdm的VGLUT1表达,但对VPM的VGLUT1,2表达水平没有显著影响.