目的:调查云南省4个艾滋病主要流行地区人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)毒株 gag基因序列的变异特征。 方法:利用完全随机抽样法抽取2019年1月至2020年12月云南省昆明市、德宏傣族景颇族自治州、红河哈尼族彝族自治州和临沧市抗病毒治疗定点机构进行随访治疗的480例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染/艾滋病患者，收集其流行病学信息，采集血浆标本后送至云南省传染病医院进行分析，采用巢式聚合酶链反应扩增HIV-1 gag基因，并进行基因分型，采用MEGA 6.06软件构建系统进化树，采用VESPA在线分析工具分析特征性氨基酸，采用Distance程序计算 gag，以及gag蛋白不同区段的基质蛋白p17、衣壳蛋白p24、核衣壳蛋白p7及p6蛋白的基因距离。采用SNAP程序分析同义突变频率与非同义突变频率比值(Ks/Ka值)。多组间统计学比较采用方差分析。 结果:404例患者成功获得 gag基因序列，其中以男性居多(250例，61.9%)，年龄为40~59岁者占59.7%(241/404)，传播途径主要为异性性传播(61.4%, 248/404)。主要流行的HIV-1亚型依次为流行重组型(circulating recombinant form, CRF)08_BC 155例(38.4%)，CRF01_AE 74例(18.3%)，独特重组型(unique rebombinant form，URF)52例(12.9%)、CRF07_BC 39例(9.7%)，C亚型34例(8.4%)，其他亚型28例(6.9%)，B亚型22例(5.4%)。构建系统进化树发现，CRF08_BC亚型形成了2个主要传播簇，2个传播簇间共有8个位点的特征性氨基酸分布存在显著差异，分别为第79、93、121、122、151、363、395和396位点。CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的 gag基因距离分别为0.090±0.004、0.088±0.004和0.078±0.002，差异有统计学意义( F＝118.33， P<0.001)。3种主要亚型中， gag区段的Ks/Ka值分别为4.003±1.309、4.141±0.860和4.514±1.215，差异有统计学意义( F＝1.35， P<0.001)；p17区段的Ks/Ka值分别为2.590±0.186、2.831±0.496和2.936±0.475，差异有统计学意义( F＝1.59， P<0.001)；p24区段的Ks/Ka值分别为12.579±1.116、10.185±0.494和8.522±0.595，差异有统计学意义( F＝1.61， P<0.001)；p7区段的Ks/Ka值分别为10.850±0.711、9.717±0.932和8.522±0.026，差异有统计学意义( F＝4.24， P<0.001)；p6区段的Ks/Ka值分别为3.122±0.134、3.040±1.498和4.841±0.353，差异有统计学意义( F＝10.68， P<0.001)。 结论:云南省4个地区中主要流行的亚型为CRF08_BC亚型，CRF08_BC的不同传播簇形成了不同的氨基酸组成模式，不同亚型 gag基因不同区段的变异程度不同，应加强对HIV变异毒株的监测，控制其流行蔓延。

目的:研究肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)中3D蛋白关键氨基酸突变对病毒增殖的影响，并根据3D三级结构模型推断突变影响病毒增殖能力的可能机制。方法:以强毒株SDLY107构建的质粒pMD19T-SDLY107-EGFP为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建病毒突变株，对突变株增殖特性进行测定。同时对3D蛋白三级结构进行预测，根据3D蛋白的结构域功能特性推测突变影响病毒增殖能力的可能机制。结果:经过双酶切鉴定和病毒基因测序证实已成功构建两株突变株病毒：EGFP-EV-A71(S37N)和EGFP-EV-A71(R142K)。两株突变株在RD细胞中的增殖速率均明显弱于亲本毒株。3D蛋白三级结构预测模型显示3D蛋白由"手指(finger)"、"拇指(thumb)"和"手掌(palm)"三个结构域构成握杯状右手结构，S37N位于"拇指"结构域，R142K位于"手指"结构域，而"拇指"和"手指"结构域对3D聚合酶的活性以及蛋白的稳定性具有重要影响。结论:S37N和R142K突变降低了EV71的复制能力，这两个突变可能是通过改变3D蛋白聚合酶活性和结构域之间的相互作用，进而影响EV71病毒增殖。

乳腺癌目前是全球女性的主要死因之一，近几年我国的乳腺癌发病率也一直呈上升趋势。现已有研究表明，关于乳腺癌易感基因的研究最充分的基因是乳腺癌易感基因1/2(BRCA1/2)，其他与乳腺癌风险增加相关的基因也已被确认，其中就包括细胞周期调定点激酶基因2(CHEK2)，它是一种编码丝氨酸/苏氨酸激酶CHEK2的肿瘤抑制基因。该基因参与DNA修复、细胞周期调节和细胞凋亡等DNA损伤反应途径。本文综述了CHEK2基因的研究现状与其在乳腺癌预防、诊断与治疗中起到的重要作用。

目的:研究巨结肠家系RET基因新发无义突变c.2599G>T是否具有致病功能。方法:利用定点突变技术构建RET c.2599G>T突变型过表达腺病毒，感染人胚肾细胞HEK-293。实验分为4组：未感染组(Control组)、阴性对照腺病毒对照组(NC组)、RET野生型过表达腺病毒组(WT组)、RET c.2599G>T突变型过表达腺病毒组(c.2599G>T组)。利用RT-PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光定位、Transwell迁移实验、CCK-8增殖实验、流式细胞凋亡检测技术，胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor，GDNF)处理细胞后检测p-RET和p-ERK1/2，探究突变RET基因的功能。多组均数间比较采用Tukey's T检验，多个研究组均数与对照组均数比较采用Dunnett- T检验。 结果:c.2599G>T组不能检测到RET全长蛋白。Transwell检测细胞迁移个数c.2599G>T组(100.80±14.72)较WT组(155.20±7.89)迁移能力下降( P<0.001)。CCK-8检测细胞增殖能力c.2599G>T组比WT组分别在24 h (0.68±0.06比0.83±0.10)、48 h(0.90±0.10比1.17±0.13)、72 h(1.07±0.11比1.401±0.19)和96 h(1.38±0.12比1.68±0.15)明显下降( P<0.05)。流式细胞技术检测凋亡，c.2599G>T组3.12%较WT组0.85%增加( P<0.001)。应用GDNF处理细胞后，蛋白质印迹法检测p-RET和p-ERK1/2蛋白表达，c.2599G>T组(0.79±0.02，5.60±0.02)较WT组(72.04±0.58，10.72±0.02)均明显下降( P<0.001)。 结论:RET基因无义突变c.2599G>T，是具有功能的新发突变，具有致病性，对先天性巨结肠的遗传咨询具有指导意义。

基因编辑技术是以改变靶基因序列为目的，实现定点突变、插入或敲除的技术。作为生命科学的新兴研究领域，基因编辑技术的不断发展与完善为基因的功能研究、基因检测和治疗提供了强有力的工具，极大地推动了生命科学的发展。本文首先介绍了基因编辑技术发展过程中的三种主要技术—锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和CRISPR-Cas9。通过改造现有Cas9核酸酶以及寻找新的具有特异性识别和切割目的序列的蛋白，适用范围更广泛的基因编辑系统被开发出来，推动了基因编辑技术的发展。本文同时对基因编辑技术的应用和存在的机遇及挑战进行了探讨，以增进对该技术及其未来研究的整体认识。

目的:研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法:采用Western Blot检测河弧菌野生株、 aphA缺失株（Δ aphA）和 aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子- lux 融合冷光系统检测野生株和Δ aphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因 tssB2 、hcp（ tssD2）和 vgrG（ tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA 相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点；采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与 hapR启动子的结合。 结果:Δ aphA中 tssB2 、hcp（ tssD2）、 vgrG（ tssI2）和 hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇 、tssD2a 、tssI2a和 hapR的启动子活性在Δ aphA中均高于野生株，而 tssD2b启动子活性则低于野生株。 tssD2a和 tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大，在 tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点，将其中的保守位点ATG替换为CGA， tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示，AphA与 hapR启动子直接结合。 结论:AphA在转录水平直接抑制 hapR的表达，间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对 tssD2a和 tssD2b呈现相反的调控模式，AphA可直接与 tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控 tssD2b的表达。

目的:人外周血淋巴细胞株8E5可分泌无感染性HIV-1病毒颗粒，靶向于8E5细胞株基因组整合的HIV-1前病毒基因POL区，基于CRISPR/Cas9点突变技术构建含有POL区耐药突变位点的单克隆细胞株，可用于制备一种安全稳定的新型HIV-1基因型耐药检测质控品。方法:设计构建小向导RNA(single guide RNA，sgRNA)和Cas9共表达载体以及携带有目标突变位点的供体单链寡核苷酸(donor single-stranded oligonucleotides，Donor ssODN)共转染8E5细胞，通过流式微孔板分选获得转染成功的阳性单克隆细胞株，通过Sanger测序确认定点突变的编辑效果。对定点突变编辑成功的单克隆细胞株培养至第3代、5代和7代的细胞及细胞分泌到上清中的HIV病毒颗粒进行Sanger测序，验证定点突变的编辑效果。结果:成功构建双sgRNA和Cas9共表达载体，与携带有耐药突变位点Q151M的Donor ssODN共转染8E5细胞株的效果良好。对分选获得的共转染阳性单克隆细胞株进行靶位点测序，结果显示成功构建了携带有定点突变Q151M的纯合子单克隆细胞株8E5 Q151M。细胞株8E5 Q151M多次传代后的细胞及细胞分泌的无感染性HIV-1病毒颗粒可被持续检测出Q151M突变位点。 结论:利用CRISPR/Cas9点突变技术成功构建稳定携带有Q151M耐药突变位点的细胞株8E5 Q151M，为制备HIV-1基因型耐药检测质控品提供新的技术平台。

目的:构建乙型肝炎病毒（HBV）C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的重组HBV复制型质粒，以期阐明其在HBx增强HBV复制中的作用。方法:利用定点突变技术在野生型HBV复制型质粒和HBx表达缺失的HBV复制型质粒基础上构建HBV C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的重组质粒。随后在HBV肝癌细胞复制模型和小鼠复制模型中进行质粒转染，提取细胞和小鼠肝组织的HBV复制中间体进行检测。结果:在HBV复制型质粒的基础上成功构建HBV C启动子近端肝富集转录因子结合位点突变的HBV复制型质粒。在HBV肝癌复制模型和小鼠复制模型中均发现HBx增强HBV的复制。突变HBV C启动子肝富集转录因子结合位点以后，HBx对于HBV复制增强的作用并未受到显著影响。结论:HBx增强HBV复制可能不通过肝富集转录因子和与HBV C启动子近端的结合位点而起作用，其他肝富集转录因子结合位点在HBx增强HBV复制中的作用仍需进一步研究。

基因编辑技术是对目标基因进行"编辑"，实现对特定DNA片段的定点突变、敲除、加入等。基因组编辑技术的真正发展距今不到五十年的时间，但这一领域已经衍生出了至少3种基因组编辑技术，包括锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术和CRISPR/Cas9等技术。这些技术都利用了DNA修复机制，特别是CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)系统，不仅是基因功能研究的强大工具，其在疾病治疗靶点的发现、病原体的核酸诊断与肿瘤等疾病的临床治疗方面也展现出巨大的潜力。当然，CRISPR/Cas9技术在实际应用中仍然存在许多潜在的问题尚待解决，例如，CRISPR/Cas9技术对基因转录的调控效果缺乏持久性和可遗传性以及存在脱靶效应等问题。为了解决这些问题，科学家以CRISPR系统为基础，开发出一套新的表观遗传基因组编辑工具CRISPRoff。本文详细介绍了CRISPRoff系统的原理，阐述了其在医学和其他领域的应用概况和技术发展。

目的:寻找散发先天性心脏病(CHD)致病基因SOX7新突变并研究其功能.方法:选取116例散发CHD患儿和228名无CHD对照儿童,对其SOX7基因进行测序分析,以发现新的致CHD突变.克隆SOX7基因并构建野生型人SOX7表达质粒,通过定点诱变产生突变型人SOX7表达质粒,使用脂质体转染多种表达质粒入HeLa细胞,应用双报告基因定量分析突变的功能效应.结果:在1例男性散发先天性室间隔缺损患儿中发现了SOX7基因新突变,即NM_031439.4:c.361C＞T;p.(Gln121*)突变;在其他115例CHD患儿和228名无CHD对照者中未检测出该突变.双报告基因定量研究表明,突变型人SOX7对其关键靶基因GATA4的转录激活作用消失.结论:SOX7基因突变可能是一部分散发CHD的病因,这对CHD的个体化防治有潜在的临床意义.