侧流免疫层析技术（LFIA）是一种快速检测技术，是将抗原抗体反应从试管或者实验器皿中移动到试纸条上进行，利用试纸条的层析作用使待测溶液向指定方向移动进而完成整个抗原抗体特异性反应，通过肉眼观察试剂条特定位置的颜色变化即可作出定性判断。因其具有快速、简便、特异性强、经济、无需专业人员的优点，现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业等领域。目前，阻碍LFIA技术发展的一大重要瓶颈就是钩效应的影响。本文旨在归纳总结目前应对钩效应的方法、手段及最新研究进展，以期为研究者在设计试纸条、对适宜纳米颗粒的选择及实现LFIA定量检测提供有力的技术参考。

目的 建立检测蔬果及饮用水等样本中的氧乐果、辛硫磷、敌百虫、对硫磷等有机磷成分的胶体金免疫层析检测方法并研制检测试纸条.方法 N-羟基琥珀酰亚法合成有机磷人工抗原;制备乙酰胆碱酯酶抗原及纯化及其抗血清制备、纯化与标记;优化试纸条工作参数,并进行性能测试.结果 抗血清效价在1∶32～1∶64之间,蛋白含量约为2 mg/mL.纯化后的多克隆抗体在相对分子质量(Mr)25 000和55 000处出现目的条带,纯度较好;试纸条反应时间在5～10 min,样本检测限为200 ng/mL,特异性及准确性良好,试纸条有效期为6个月.结论 建立了简便快速检测多种有机磷成分的胶体金免疫层析检测方法,适合大量样本的现场初筛.

[背景]由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2,CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失.[目的]开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2 和监测鲫CyHV-2 IgM抗体水平的胶体金检测试纸条.[方法]将CyHV-2 与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66 多克隆抗体进行划线作为质控线,分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件,确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度,以及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最适划线浓度等.[结果]本研究制备的CyHV-2 抗体胶体金试纸条可以使用全血测试,与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应,如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等.试纸条最低限度可以检测到 1:100 稀释的阳性血清抗体,由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平.试纸条通过对 10 条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194-2018)进行Kappa分析,Kappa值为 0.80,表明二者有较高的符合率.[结论]本研究制备的试纸条具有较高的灵敏度和特异性,具有操作简单和成本较低的特点,对鱼类检疫、鱼体抗体水平评价等具有实际应用价值.

本研究旨在建立一种简便、快捷、可直观检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的检测方法.将pET-32a-N重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,以纯化的PPRV N蛋白免疫 8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)筛选及亚克隆,获得了抗PPRV N蛋白的单克隆抗体.将PPRV N蛋白分别作为金标抗原及检测线(T线)包被抗原、单克隆抗体作为质控线(C线)包被抗体,组装成检测PPRV N蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条.结果显示:成功获得 1 株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为 1F1;间接ELISA检测 1F1 腹水效价为 1:128 000;亚类鉴定结果为IgG1,轻链为kappa链.Western blotting结果显示,1F1 能与PPRV N蛋白特异性结合;间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)结果显示,制备的单克隆抗体能够识别PPRV;建立的试纸条能够特异性地检测PPRV抗体,以不同批次的试纸条重复检测,结果无差异.根据 122 份临床血清的检测结果,PPRV抗体试纸条与ELISA试验的符合率为 97.6%.本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、重复性和敏感性,可用于PPRV抗体的快速检测.

目的:改良巨细胞病毒IgM抗体检测试纸条,以消除IgG抗体干扰,提高检测准确度.方法:该试纸条采用胶体金免疫层析法制备,以鼠抗人IgM抗体作为金标抗体.首先,制备胶体金标记抗体,并制成胶体金垫.其次,沿着层析方向在硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜上依次设置IgG抗体拦截线I、检测线T及对照线C,并在检测线T处包被1.5 mg/mL的巨细胞病毒重组抗原,在对照线C处包被0.5 mg/mL的羊抗鸡IgY抗体,在拦截线I处包被3.0 mg/mL的鼠抗人IgG抗体.最后,将胶体金垫、NC膜、吸水纸、样品垫等粘贴在聚氯乙烯底板上,制成试纸条,并对其性能进行评价.结果:该试纸条可有效降低样本中效价≤1 280的IgG抗体对检测结果的干扰,且在检测国家参考品时的准确度、最低检出限及重复性均符合要求.该试纸条与10种相近病原体无交叉反应,且与酶联免疫吸附试剂盒的检测结果具有较高的一致性.结论:改良后的巨细胞病毒IgM抗体检测试纸条可消除IgG抗体干扰,且检测高效方便、准确度高,能更好地满足基层单位临床检验的需要.

目的 为实现快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2),干预和防止病毒的传播,研制一种基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条.方法 通过设计基于ORF1ab和N基因靶序列内的正反两个依赖原间隔邻近基序(PAM)位点crRNAs,将恒温扩增技术与CRISPR-Cas12a检测相结合,并结合侧向层析试纸条技术,实现对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因同时扩增与双重CRISPR的可视化检测.结果 检测试纸条可在37 ℃条件下20 min内取得结果,具有较好的灵敏度、特异度及热稳定性.对SARS-CoV-2假病毒的检测灵敏度为250 copy/mL,检测16种其他呼吸道病原体均无交叉反应,在37 ℃条件下存放8 d仍然具有较好检测效果.临床研究显示,检测SARS-CoV-2总符合率为95.00％(57/60).结论 基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于SARS-CoV-2的现场快速检测.

目的 制备一种快速检测β淀粉样蛋白(Aβ)的试纸条,为阿尔茨海默病(AD)的辅助诊断提供新工具.方法 采用免疫层析技术,以胶体金标记的Aβ42单克隆抗体为标记物,将特异性识别Aβ42蛋白的包被单克隆抗体固化于硝酸纤维素膜上作为检测抗体,以Aβ42抗原为质控,制备胶体金快检试纸条.通过盐析实验选择胶体金的最适标记pH以及最适标记蛋白浓度;对包被抗体的包被浓度、划线浓度以及金标物的复溶液量、喷量等一系列工艺进行优化,成功研制出胶体金免疫层析试纸条并对该试纸条的敏感性、特异性、稳定性进行评估.结果 该试纸条可有效检测出1∶1×103～1∶5×106稀释范围内的Aβ42抗原,且同批次试纸条检测结果一致,且与Aβ40无交叉反应.结论 该试纸条具有较高的敏感性、特异性和稳定性,为AD快速筛查提供了新手段.

目的 建立猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)A35R蛋白现场快速半定量检测胶体金免疫层析方法.方法 以微波法6 min快速合成金纳米颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)作为标记物,基于双抗体夹心法体系建立检测MPXV A35R蛋白的免疫层析试纸方法.利用真核系统表达的MPXV包膜成分A35R蛋白配制系列浓度标准液,初步评价胶体金免疫层析试纸条的敏感性、特异性及稳定性等检测性能.结果 20 min内完成检测,建立MPXV抗原的胶体金免疫层析试纸的半定量检测的灵敏度达到62.5pg/mL,肉眼最低检测限是125 pg/mL.与登革病毒(Dengue virus,DENV)、诺如病毒(No-rovirus,NV)均无交叉反应,稳定性良好.结论 本研究建立的胶体金半定量免疫层析试纸条可以实现对MPXV的快速灵敏检测,在MPXV的即时检测(Point of care testing,POCT)领域具有一定潜力.

目的 探讨尿微量白蛋白检测在肾损伤早期诊断及治疗中的应用.方法 收集糖尿病及体检健康人群的随机尿,使用自动生化分析仪和胶体金检测尿微量白蛋白水平.结果 糖尿病组尿微量白蛋白显著高于对照组(P<0.05).胶体金法与自动生化仪器法对健康人群的检测基本一致.结论 胶体金法测定尿微量白蛋白结果准确、稳定,能较早地反映肾损伤情况,适合家庭的动态监测.

目的 获得吸毒者唾液和尿液检材中甲基苯丙胺浓度分布及胶体金试剂条初筛情况.方法 液相色谱串联质谱法获得吸毒者唾液和尿液检材中甲基苯丙胺浓度,通过胶体金试剂条检测获得初筛情况.对两者结果进行比对分析.结果 采用直接沉淀蛋白法和液质MRM扫描法检测,唾液线性范围是1~100ng/mL,线性相关系数0.9987,检出限是0.1ng/mL,定量限是1ng/mL;尿液线性范围是1~100ng/mL,线性相关系数0.9943,检出限是0.5ng/mL,定量限是1ng/mL.唾液和尿液检材按一定比例稀释,使浓度在线性范围内.采用唾液和尿液四种型号甲基苯丙胺胶体金试剂条初筛,直接点样,目测判断结果.结论 胶体金试纸条初筛尿液检出率为79%左右;唾液检出率大概为81%,两种试剂条结合使用,检出率可以提高到93%以上.结合此次初筛结果和仪器确认浓度可以发现:灰区设置和灵敏度的设置对检出率有一定影响,建议提高灵敏度以满足筛查工作需要.