文昌鱼(Branchiostoma sp)属脊索动物门(Chordata)头索动物亚门(Cephalochordata),是研究动物演化和系统发育的优良实验材料[1].文昌鱼、味道鲜美,蛋白质含量高于带鱼、黄花鱼、牡蛎、鲳鱼,富含不饱和脂肪酸、铁、磷、维生素.文昌鱼主要分布于大西洋、印度洋和太平洋沿岸及一些海岛周围[2].我国有白氏青岛文昌鱼(Branchiostma belcheri tsingtauensis)[3]、白氏文昌鱼(Branchiostma belcheri)、日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)[4]三个亚种.

为探讨Smad1/5基因在贝类生长发育中的调控作用,利用RACE技术克隆获得文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因的cDNA全长序列,对其生物信息学、不同组织和不同发育时期时空表达特征进行分析,并利用直接测序法分析了外显子区域SNP位点与生长性状的相关性.结果表明:Mm-Smad1/5的cDNA全长序列为1832 bp,开放阅读框1380 bp,编码459个氨基酸;氨基酸多序列比对显示,Mm-Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的一致性分别为83.7%和80.2%,与人、鸡、非洲爪蟾等脊椎动物Smad 1、Smad 5氨基酸序列的一致性达到70.5%以上,说明该基因具有较高的保守性;结构域预测发现,Mm-Smad1/5含有Smads蛋白家族特有MH1、MH2两个高度保守结构域.荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,Mm-Smad1/5基因在成体6个组织均有表达,尤其在斧足、外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.05);Mm-Smad 1/5基因在各发育时期广泛表达, 从原肠胚期开始大量表达, 一直持续到壳顶幼虫期, 而从眼点幼虫大量下降, 稚贝时期又有所上升.Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点相关分析表明,共发现了9个SNP位点,其中936 G>T位点与文蛤的生长性状显著相关(P<0.05).Mm-Smad1/5基因在文蛤生长发育中发挥重要调控作用, 可作为高产良种选育的候选基因, 而生长关联SNP位点分析将为文蛤分子标记辅助育种研究奠定重要基础.

为了解钦州湾浮游动物群落的时空分布特征及与主要环境因子的关系,于2014年10月和2015年3月进行了秋季和春季两航次的调查.结果表明:该海湾的浮游动物群落有明显的季节变化.秋季共鉴定出12类87种,其中优势种有太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)、肥胖三角溞(Evadne tergestina)、亨生莹虾(Lucifer hanseni)、百陶箭虫(Sagitta bedoti)和长尾类幼虫(Macrura larvae);春季共鉴定出11类48种,优势种为中华哲水蚤(Calanus sinicus)和太平洋纺锤水蚤;秋季浮游动物的平均丰度、生物量和多样性指数(528.92个/m3、110.60 mg/m3和2.22)均高于春季(48.30个/m3、61.10 mg/m3和1.70).空间分布上,钦州湾外湾浮游动物丰度、生物量和多样性指数的平均值皆高于内湾.多维尺度分析表明,秋季内湾群落相似性较高,春季外湾浮游动物群落相似性较高.相关性分析表明盐度与营养盐是影响钦州湾浮游动物分布的主要环境因子.与2011-2012年数据相比,钦州湾浮游动物群落结构已趋于单一化和小型化,以致生物量明显下降.这一现象主要与钦州湾海水富营养化以及大面积高密度牡蛎养殖有密切的关系.

组织蛋白酶C在无脊椎动物中具有重要的非特异性免疫防御功能.为了研究马氏珠母贝组织蛋白酶C(Pm-CTSC)的功能,本实验利用RACE技术克隆获得了Pm-CTSC,并对其结构和组织表达模式进行了分析.结果表明:Pm-CTSC基因cDNA序列全长为1 914bp,其中开放式阅读框1 413 bp,5'UTR 25 bp,3'UTR 476 bp,共编码470个氨基酸,该蛋白理论分子量为53.41 kD,理论等电点为6.03.结构域分析发现Pm-CTSC具有组织蛋白酶C两个典型的结构域Cathepsin C exclusion和Peptidase_C 1A_CathepsinC.多序列比对结果表明Pm-CTSC与太平洋牡蛎的同源性最高,为68.8％;系统进化分析发现,Pm-CTSC与无脊椎动物聚为一支.qRT-PCR表达分析发现,Pm-CTSC在肝胰腺中显著高表达(p＜0.05),表明Pm-CTSC可能参与马氏珠母贝的免疫应答.本研究为进一步探讨组织蛋白酶C在马氏珠母贝天然免疫应答中的作用提供了基础资料.

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是合成单不饱和脂肪酸的限速酶.本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝SCD (Pm-SCD)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及在鳃中不同温度下的时序表达模式.序列分析表明,Pm-SCD cDNA序列全长为1 588 bp,其中开放式阅读框948 bp,5'UTR 200 bp,3'UTR 440 bp,编码315个氨基酸,理论蛋白分子量为36.52 kD,理论等电点为9.63.SMART软件分析显示Pm-SCD蛋白具有SCD典型的脂肪酸去饱和酶结构域FA_desaturase,以及3个组氨酸簇和3个跨膜区.多序列比对结果表明Pm-SCD与太平洋牡蛎SCD同源性最高,为68％;系统进化分析发现,Pm-SCD与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支.组织表达定量分析结果显示,Pm-SCD在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在性腺中表达量最高;对不同温度下鳃组织中Pm-SCD的时序表达分析发现,在处理后各时间点低温组(17℃)基因表达水平最高,且均显著高于对照组(22℃)、高温组(32℃).以上结果表明Pm-SCD可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应.该研究为进一步探索Pm-SCD在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料.

细胞粘附分子3 (cell adhesion molecule 3,CAM3)是免疫球蛋白家族(immunoglobulin family,IgSF)的一员,在细胞黏连、外源病原体的识别等方面具有重要作用.本实验利用末端快速克隆(RACE)技术,克隆获得马氏珠母贝(Pinctada facata martensii)细胞粘附分子3的全长序列(Pm-CAM3),并使用荧光定量PCR(Real-time PCR,qRT-PCR)技术检测了Pm-CAM3在马氏珠母贝不同组织中的表达模式.结果显示,Pm-CA M3基因全长2 245 bp.其中5'UTR 335 bp,3'UTR 166 bp,开放阅读框(ORF)长度为l 744bp,共编码581个氨基酸;预测其相对分子量为63.21 kD,等电点为5.07,脂溶指数(aliphatic index)为67.21;总平均亲水性(grand averageofhydropathy,GRAVY)为-0.549,属于亲水性蛋白;Pm-CAM3具有跨膜结构域,其胞外区域具有一个IgSF家族典型的Ig结构域以及一个Ig-like结构域.多序列比对结果显示,Pm-CAM3在物种间的保守性较低,其中Pm-CAM3与太平洋牡蛎的CAM3(Crassostreagigas,Cg-CAM3)的氨基酸序列相似性最高,但仅为37％.qRT-PCR分析表明Pm-CAM3在马氏珠母贝的9个组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高(p＜0.05).本研究为进一步阐述Pm-CAM3在马氏珠母贝先天免疫中的作用提供基础资料.

组织蛋白酶L (cathepsin L,CTSL)是无脊椎动物体内非特异性免疫的重要组成部分.为了研究马氏珠母贝CTSL (Pm-CTSL)的功能,本实验利用RACE技术克隆获得了Pm-CTSL基因,并对其结构和组织表达模式进行了分析.结果表明,Pm-CTSL基因cDNA序列全长为1 237bp,其中开放式阅读框957 bp,5'UTR69 bp,3'UTR211 bp,共编码氨基酸318个.结构域分析发现Pm-CTSL具有CTSL两个典型的结构域Inhibitor_I29和Pept_C1.Pm-CTSL也具有信号肽、保守序列ERFNVN和GNFD、两个潜在的N-糖基化位点和催化活性位点三联体残基(Cys,His和Ash).多序列比对结果表明Pm-CTSL与太平洋牡蛎的同源性最高,为42％;系统进化分析发现,Pm-CTSL与虾夷扇贝等贝类聚为一支.实时荧光定量分析发现,Pm-CTSL在肝胰腺中显著高表达(p＜0.05),表明Pm-CTSL可能参与马氏珠母贝的免疫应答.本研究为进一步探讨CTSL在马氏珠母贝非特异性免疫应答中的作用提供了基础资料.

防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,是软体动物抵御各种病原微生物侵染的重要免疫因子.太平洋牡蛎防御素(Crassostrea gigas defensin,CgD)近羧基端的43个氨基酸残基构成了其成熟肽区域,决定了CgD的生物学活性.首先通过逆转录PCR和设计特异性引物从太平洋牡蛎外套膜中分离并扩增到3'端添加和不添加6×His标签的两种目的基因CgDH+和CgDH-;与pPICZαA连接后构建的重组表达载体(pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-)电转至毕赤酵母Pichia pastoris X-33中,使用1.0％甲醇诱导表达目的蛋白CgDH+和CgDH-,最适培养条件为29℃、250 r/min、72 h;通过固化金属离子亲和层析(IMAC)获得分子量为5.78 kDa的纯化的重组蛋白CgDH+,根据其蛋白质浓度推算表达量为2.32 mg/Lo经MALDI-TOF-TOF质谱分析证明纯化产物即为预期的目的蛋白.抑菌试验结果显示分别含重组蛋白CgDH+和重组蛋白CgDH-的培养液上清对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa都具有抑菌活性,表明重组蛋白中6×His标签的存在与否并不影响其生物学活性.

己糖激酶(hexokinase,HK)是糖酵解过程中的首个限速酶.本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HK (Pm-HK)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式.序列分析表明,Pm-HK cDNA序列全长为2 403 bp,其中开放式阅读框1 548 bp,5'UTR 74 bp,3'UTR 781 bp,共编码515个氨基酸,分子量为57.67 kD,理论等电点为6.08.结构域分析发现Pm-HK具有两个完整的保守功能域Hexokinase_1、Hexokinase 2,以及两个Glucose-6-Phosphate结合位点、三个Glucose结合位点,两个ATP结合位点.多序列比对结果表明Pm-HK与太平洋牡蛎HK同源性最高,为81％;系统进化分析发现,Pm-HK与太平洋牡蛎等贝类HK聚为一支.组织表达定量分析结果显示,Pm-HK在马氏珠母贝肝胰腺中显著高表达:对不同温度下鳃组织中Pm-HK的时序表达分析发现,在处理12h后各时间点低温组(12℃)Pm-HK基因表达水平最高,且均显著高于中低温组(17℃)、对照组(22℃)和高温组(32℃).以上结果表明Pm-HK可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应.该研究为进一步探索Pm-HK在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料.

超氧化物歧化酶(SOD)通过清除生物体内产生的超氧化物而发挥抗氧化作用,其中,胞外超氧化物歧化酶(Ec-SOD)是重要细胞外抗氧化蛋白,但存在于牡蛎血浆内的Ec-SOD同源蛋白已经证实没有SOD酶活性.在太平洋牡蛎基因组中鉴定到3个与美洲牡蛎dominin高度相似的序列片段,并通过RT-PCR克隆验证均为表达基因,将其中的Cg-dominin 2成熟多肽在大肠杆菌中重组表达获得重组蛋白.抗氧化活性测定显示,重组Cg-dominin2的总抗氧化活性相当于0.0525 mmol/g Trolox.将太平洋牡蛎以不同浓度的Cd2+,Zn2+进行胁迫刺激,定量PCR检测显示Cg-dominin2基因的相对表达量有显著上调,血浆蛋白的对应金属含量也有所增加.上述结果提示太平洋牡蛎胞外超氧化物歧化酶同源蛋白可能通过参与体内金属代谢过程从而在抵御重金属胁迫中发挥作用.