采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STA RDL3基因cDNA全长序列(Pm-STA RDL3);利用荧光定量技术检测Pm-STA RDL3基因在各个组织中的表达量.结果表明,Pm-STA RDL3基因cDNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编码496个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长110 bp,3'UTR长2 054 bp.Pm-STARDL3氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis) STARDL3的序列的相似度最高.SMART软件分析得出,Pm-STARDL3有STARD类蛋白特有的结构域.荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌,各组织的表达量差异具统计学意义(p＜0.05).

TLR13 (Toll like receptor 13)是一种TLR模式识别受体,属于TLR11家族,在机体抵抗细菌、真菌、病毒和寄生虫的感染过程起重要的作用.为研究马氏珠母贝TLR13 (PmTLR13)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,本研究采用RACE扩增技术获得了PmTLR13基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测PmTLR13基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式.结果显示,PmTLR13基因序列全长2 750 bp,其中5'UTR长为25 bp,3'UTR长为34 bp,开放阅读框(ORF)为2 106 bp,编码701个氨基酸,预测其分子量约为81.22 kD,等电点为8.77.SMART分析结果显示PmTLR13具有富含亮氨酸的重复序列(LRRs)、TIR域、跨膜域和信号肽,符合典型的TLR家族特征;多序列比对结果表明物种间TLR13具有较高的保守性;RT-PCR数据分析表明,PmTLR13基因在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、中央膜区、边缘膜区中均有表达,其中鳃中表达量最高,其次是外套膜边缘区和肝胰腺.研究结果表明,PmTLR13可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色.

清道夫受体(scavenger receptors,SRs)作为一类先天性免疫受体,在宿主固有免疫防御中起着重要的作用.本研究采用RACE技术首次从马氏珠母贝cDNA文库中克隆出一个新型的马氏珠母贝SR基因全长序列pmSR),并且运用qRT-PCR技术检测了pmSR基因在马氏珠母贝不同组织中的表达情况和哈维氏弧菌刺激后在血淋巴中的时序表达模式.结果显示,PmSR基因序列全长为954 bp,5'UTR长为107 bp,3'UTR长为169bp,开放阅读框为678 bp,其编码225个氨基酸;PmSR氨基酸序列含有α卷曲螺旋结构和具有6个保守的半胱氨酸的SRCR域(scavenger receptor cystein rich domain),具有A型SRCR结构域的典型特征.SRCR结构域氨基酸序列多序列比对显示PmSR的SRCR结构域与老鼠和斑马鱼MARCO (macrop Hagereceptor with collagenous structure,MARCO) SRCR相似度最高,分别为44％和43％;且蛋白质聚类分析表明PmSR与SR-AI (class A scavenger receptor I,SR-AI)同源性最高.qRT-PCR结果显示,PmSR基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃中均有表达,在肝胰腺表达量最高;哈维式弧菌(Vibrio harveyi)刺激后,血淋巴中PmSR基因表达量在0～8 h逐渐上升,并于8h达到最大表达量,约为对照组(0 h)的4.2倍,表达量随后下降,直至16h后,其表达量再次出现显著性上升,结果具有显著性差异(p＜0.05).本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了重要资料.

2012 年4 月,利用马氏珠母贝全同胞家系进行家系内与家系间交配组合构建了近交家系(A 与D)与杂交家系(B 与C).贝龄2 龄时,比较家系生长性状差异,利用甲基化敏感多态性扩增技术(MSAP)检测了4个家系甲基化水平的差异,估计了甲基化比例与生长性状平均值相关性系数.结果表明,家系杂交子代的平均壳长、平均壳高、平均壳宽与平均体重均值大于近交家系,性状优势率为8.5％～24.7％;近交家系与杂交家系的总条带数和甲基化比例均存在显著性差异(p＜0.05).近交家系A 和D 获得的总条带数分别729.0±19.6与717.3±28.2,甲基化水平分别为(10.0±0.9)％与(8.5±0.4)％;杂交家系B 和C 获得的总条带数分别为703.0±10.7与726.3±18.8,甲基化比例分别为(5.9±0.7)％与(5.7±0.9)％;家系的平均壳长、平均壳高、平均壳宽与平均体重性状与甲基化均存在明显负相关,相关系数分别为-0.849、-0.751、-0.674 和-0.652.

β-N-乙酰-己糖胺酶(beta-N-acetylhexosaminidase/beta-Hexosaminidase,HEX)是一种糖苷水解酶,在几丁质降解、N-糖基化修饰、糖复合物代谢等过程发挥重要作用.为了探究PmHEX在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得马氏珠母贝PmHEX (Pinctada fucata martensii HEX,PmHEX)cDNA全长序列并通过qRT-PCR检测其在不同组织的表达模式.结果表明,PmHEX序列全长3 812 bp,其中5'UTR为22 bp,3'UTR为364 bp,开放阅读框(ORF)为3 426 bp,编码1 141个氨基酸;预测其相对分子量为125.92 kD,理论等电点为9.06;SMART软件分析PmHEX蛋白质序列,发现它具有典型的GH20和GH20b结构域和一个碳水化合物结合结构域;多序列比对显示PmHEX与其它物种的HEX具有较高的保守性,与珠母贝HEX序列相似度高达54％;qRT-PCR表达分析显示PmH EX在外套膜各区表达量较高,且在边缘区的表达量显著高于其他组织.综上所述,PmH EX可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程.

胃内因子(gastric intrinsic factor,GIF)是一种转运蛋白,在介导维生素B12 (VB12)维持机体正常造血功能、神经系统功能和免疫调节功能等方面发挥重要作用.为探究胃内因子样蛋白(gastric intrinsic factorlike protein,GIFLP)在马氏珠母贝免疫调节中的作用,本研究运用RACE技术获得马氏珠母贝胃内因子样蛋白基因(PmGIFLP)的cDNA序列全长,并检测PmGIFLP在各个组织的表达模式.结果表明:PmGIFLP序列全长l 721 bp,其中5′UTR为78 bp,3′UTR为116 bp,开放阅读框(ORF)为1527bp,编码508个氨基酸.预测其分子量(MW)为56 644.84 Da,理论等电点(pI)为7.13.SMART软件分析显示PmGIFLP氨基酸序列具有2个典型的钴胺素结合结构域.多序列比对发现PmGIFLP与其它物种的同源性较低.qRT-PCR结果表明Pm-GIFLP基因在肝胰腺中显著高表达,其次是外套膜边缘区、性腺和足.综上所述,PmGIFLP可能参与马氏珠母贝的免疫调节作用,可为进一步探究PmGIFLP在马氏珠母贝中免疫防御中的作用积累基础资料.

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体属于是一类离子型谷氨酸受体,并且与脊椎动物和无脊椎动物的突触可塑性,记忆采集和学习等密切相关.本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝(Pinctada martensii) NR1型受体基因(PmNR1) cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测了PmNR1在马氏珠母贝各组织中的表达谱和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后肝胰脏中的表达模式.结果显示,PmNR1cDNA全长2 969 bp,其中5'非编码区(UTR)长95 bp,3'UTR长42bp,开放阅读框(ORF)长2382bp,编码943个氨基酸;PmNR1含有信号肽,两个配体结构域,一个预测的甘氨酸和谷氨酸结合位点,三个跨膜域,以及一个发夹式结构域,一个NR1亚基的钙调蛋白结合结构域;多序列比对结果表明物种间NR1具有较高的保守性,且与长牡蛎的相似度达61.19％.qRT-PCR结果表明,PmNR1在马氏珠母贝实验组织中都有表达,在肝胰脏、鳃、性腺和外套膜中表达量较高(p＜0.05);LPS刺激后肝胰脏中PmN1基因表达量在4h逐渐下降,并于8h达到最低表达量,约为对照组(0h)的2.6倍,随后的12～24h表达量开始回升,并于24 h恢复到原有水平,结果具有显著性差异(p＜0.05).

本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝Δ6-脂肪酸去饱和酶(Pm-Δ6FAD)基因,并对其进行生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式.序列分析表明,Pm-Δ6FAD cDNA序列全长为1 491 bp,其中开放式阅读框1125bp,5'UTR 225 bp,3'UTR 141 bp,编码374个氨基酸,理论蛋白分子量为42.72 kD,理论等电点为8.27.SMART软件分析显示Pm-Δ6FAD蛋白具有Δ6FAD典型的脂肪酸去饱和酶结构域FA_desaturase,以及3个组氨酸簇和6个跨膜区.多序列比对结果表明Pm-Δ6FAD与虾夷扇贝Δ6FAD同源性最高,为63％;系统进化分析发现,Pm-Δ6FAD与软体动物聚为一支.组织表达定量分析结果显示,Pm-Δ6FAD在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在性腺中表达量最高;对不同温度下鳃组织中Pm-Δ6FAD的时序表达分析发现,在处理后各时间点低温组(17℃)基因表达水平最高,且均显著高于高温组(32℃).以上结果表明Pm-Δ6FAD可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应.该研究为进一步探索Pm-Δ6FAD在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料.

组织蛋白酶C在无脊椎动物中具有重要的非特异性免疫防御功能.为了研究马氏珠母贝组织蛋白酶C(Pm-CTSC)的功能,本实验利用RACE技术克隆获得了Pm-CTSC,并对其结构和组织表达模式进行了分析.结果表明:Pm-CTSC基因cDNA序列全长为1 914bp,其中开放式阅读框1 413 bp,5'UTR 25 bp,3'UTR 476 bp,共编码470个氨基酸,该蛋白理论分子量为53.41 kD,理论等电点为6.03.结构域分析发现Pm-CTSC具有组织蛋白酶C两个典型的结构域Cathepsin C exclusion和Peptidase_C 1A_CathepsinC.多序列比对结果表明Pm-CTSC与太平洋牡蛎的同源性最高,为68.8％;系统进化分析发现,Pm-CTSC与无脊椎动物聚为一支.qRT-PCR表达分析发现,Pm-CTSC在肝胰腺中显著高表达(p＜0.05),表明Pm-CTSC可能参与马氏珠母贝的免疫应答.本研究为进一步探讨组织蛋白酶C在马氏珠母贝天然免疫应答中的作用提供了基础资料.

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是合成单不饱和脂肪酸的限速酶.本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝SCD (Pm-SCD)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及在鳃中不同温度下的时序表达模式.序列分析表明,Pm-SCD cDNA序列全长为1 588 bp,其中开放式阅读框948 bp,5'UTR 200 bp,3'UTR 440 bp,编码315个氨基酸,理论蛋白分子量为36.52 kD,理论等电点为9.63.SMART软件分析显示Pm-SCD蛋白具有SCD典型的脂肪酸去饱和酶结构域FA_desaturase,以及3个组氨酸簇和3个跨膜区.多序列比对结果表明Pm-SCD与太平洋牡蛎SCD同源性最高,为68％;系统进化分析发现,Pm-SCD与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支.组织表达定量分析结果显示,Pm-SCD在马氏珠母贝多个组织中均有表达,在性腺中表达量最高;对不同温度下鳃组织中Pm-SCD的时序表达分析发现,在处理后各时间点低温组(17℃)基因表达水平最高,且均显著高于对照组(22℃)、高温组(32℃).以上结果表明Pm-SCD可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应.该研究为进一步探索Pm-SCD在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料.