目的:构建猪带绦虫重组质粒pET30a-富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域15（LRRC15），原核表达纯化的LRRC15重组蛋白，制备兔多克隆抗体。方法:采用全基因合成方法，获得猪带绦虫LRRC15蛋白编码基因；将其克隆至pET30a载体，构建重组质粒pET30a-LRRC15，并进行双酶切PCR鉴定；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达LRRC15重组蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析鉴定表达产物；用Ni-IDA亲和层析柱纯化LRRC15重组蛋白，SDS-PAGE进行分析鉴定；蛋白质印迹法（Western blot，WB）鉴定纯化重组蛋白特异性；用纯化的LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔，制备LRRC15多克隆抗体，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定纯化多克隆抗体的效价。结果:经PCR鉴定，扩增出长度为1 506 bp的条带，与LRRC15基因相符；经SDS-PAGE和WB鉴定，获得相对分子质量（ Mr）约为55.36 × 10 3的LRRC15目的蛋白；用LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔，获得LRRC15多克隆抗体，其效价为1∶1 587 200。 结论:成功构建重组质粒pET30a-LRRC15，制备出猪带绦虫LRRC15重组蛋白，并获得了高纯度、高效价的LRRC15重组蛋白兔抗多克隆抗体。

目的 探讨富含亮氨酸重复序列15(LRRC15)、SUN结构域蛋白2(SUN2)在上皮性卵巢癌(EOC)组织中的表达变化及其与患者预后的关系.方法 选取102例EOC患者手术切除癌组织(观察组),以60例因卵巢良性囊肿行手术治疗的正常卵巢组织为对照组.采用免疫组化法检测癌及正常卵巢组织中LRRC15、SUN2表达.通过Spearman秩相关分析评估LRRC15与SUN2表达的相关性,采用Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归分析LRRC15、SUN2表达与EOC患者预后的关系.结果 观察组LRRC15阳性率高于对照组,SUN2阳性率低于对照组,差异有统计学意义(P均＜0.05).观察组中LRRC15与SUN2表达呈负相关(r=-0.634,P＜0.05).LRRC15在EOC患者FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移中的阳性率高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织,SUN2在EOC患者FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移中的阳性率低于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织,差异有统计学意义(P均＜0.05).LRRC15阳性组EOC患者3年总生存率低于LRRC15阴性组,SUN2阴性组EOC患者3年总生存率低于SUN2阳性组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).FIGO分期Ⅲ期、病理分级Ⅲ级、淋巴结转移、LRRC15阳性是影响EOC患者预后的危险因素,SUN2阳性是保护因素(P均＜0.05).结论 EOC患者癌组织中LRRC15表达升高、SUN2表达降低,LRRC15、SUN2表达与EOC肿瘤进展有关,检测二者水平有助于评估EOC患者预后.

目的 基于机器学习筛选类风湿关节炎(RA)的诊断标志基因,并分析可能的免疫浸润机制,为RA的临床治疗提供参考.方法 从基因表达综合(GEO)数据库下载 RA 基因表达谱芯片数据集,将GSE55235 和GSE77298 作为联合芯片训练集,GSE55457 作为独立验证数据集.使用R软件进行差异表达基因(DEGs)的筛选,并对这些DEGs进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析.进一步应用三种机器学习算法筛选诊断基因,并进行外部验证和受试者工作特征(ROC)曲线分析.通过xCell算法分析免疫细胞在RA中的浸润情况.结果 筛选出RA的DEGs共 704 个.富集分析发现这些DEGs主要涉及白细胞介导的免疫、免疫应答的激活、白细胞迁移等相关免疫功能,以及趋化因子信号通路、利什曼病、类风湿关节炎等相关炎症通路.通过机器学习筛选出4 个诊断基因,包括趋化因子CXC配体13(CXCL13)、富含亮氨酸重复序列结构域15(LRRC15)、多配体蛋白聚糖-1(SDC-1)和核酸结合蛋白3(YBX3).免疫浸润分析结果显示,在RA中B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞和单核细胞的水平显著上调(P＜0.05).结论 RA的发生发展是多基因、多通路共同参与的结果,CXCL13、LRRC15、SDC-1 和YBX3 可能是诊断RA的潜在生物标志物.B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞和单核细胞可能在RA的发生中具有重要意义.

目的 探讨猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen,ESA)富含亮氨酸重复序列结构域(Leucine-rich repeat containing 15,LRRC15)蛋白对仔猪树突状细胞(Dendritic cell,DC)成熟活化的影响.方法 收集正常仔猪DC体外诱导、培养,获得成熟与未成熟DC(immature DC,imDC).在正常仔猪未成熟DC中,分别加入LRRC15蛋白、ESA刺激,将LRRC15组作为实验组;同时建立ESA对照组、LPS阳性对照组、LRRC15+LPS阳性对照组、LPS+ESA阳性对照组和培养基阴性对照组.流式细胞术检测DC表面标志物MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达量;ELISA检测DC细胞培养上清TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12的分泌水平.结果 与未刺激DC组相比,LRRC15蛋白组诱导DC表面标志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达均增加.在LPS存在情况下,LRRC15蛋白也能诱导CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子上调;ELISA检测结果显示,与1640培养基组、LPS组和ESA组相比,LRRC15蛋白组均诱导IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌 降低,LRRC15蛋白组与1640培养基组相比 IL-6(t=7.529,P＜0.05),IL-10(t=2.780,P＜0.05),IL-12(t=4.673,P＜0.05),TNF-α(t=2.894,P＜0.05);LRRC15蛋白组与 LPS 组相比 IL-6(t=26.663,P＜0.05),IL-10(t=12.038,P＜0.05),IL-12(t=27.594,P＜0.05),TNF-α(t=29.540,P＜0.05);LRRC15 蛋白组与 ESA 组相比 IL-6(t=6.343,P＜0.05),IL-10(t=2.579,P＜0.05),IL-12(t=8.102,P＜0.05),TNF-α(t=3.890,P＜0.05).ESA组与1640培养基组相比能诱导IL-12分泌(t=3.430,P＜0.05),其他细胞分子分泌水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 LRRC15蛋白能诱导DC成熟活化,并抑制DC相关细胞因子的分泌,但能否通过其他途径诱导Th细胞分化还需进一步分析.

目的 对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中差异表达蛋白富含亮氨酸重复序列结构域15(leucine-rich repeat containing 15,LRRC15)进行真核表达,并预测其抗原表位.方法 通过在线软件ExPASy-PortParam和Protean软件预测LRRC15蛋白分子质量、稳定性、氨基酸序列组成及等电点和T淋巴细胞抗原表位.采用基于PCR的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)技术设计全长拼接引物,合成LRRC15基因.构建重组质粒pcDNA3.4-LRRC15并转染至人胚胎肾细胞HEK293,表达LRRC15蛋白,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blotting)鉴定.结果 成功构建了重组质粒pcDNA3.4-LRRC15,表达分子质量约70 kDa的LRRC15目的蛋白.经ExPASy-PortParam软件预测,LRRC15属于亲水性蛋白,由644个氨基酸组成,分子质量为69.89 kDa,等电点为5.6;蛋白分子式为C3073H4942N846O953S28,不稳定系数为50.3,为一种不稳定蛋白.采用Protean软件预测发现,LRRC15蛋白位于292～295、353～361、521～526、555～564位氨基酸区段具有T细胞抗原表位优势,具有亲水性高、柔韧性好、表面可及性大、抗原性指数高的表位位于122～131、216～233、249～254、333～343、358～361、368～372、384～386、407～412、445～450、469～481、553～564、588～594、607～617、624～639位氨基酸区段.将重组质粒pcDNA3.4-LRRC 15转染至HEK293细胞后,SDS-PAGE和Western blotting分析发现,在细胞分泌培养基、细胞裂解上清和沉淀中检测到LRRC15蛋白.从细胞培养基中纯化出LRRC15-His融合蛋白,SDS-PAGE显示在分子质量约为70 kDa处出现明显条带,Western blotting能够识别LRRC15重组蛋白条带.结论 成功对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中的LRRC15蛋白进行真核表达,并对其抗原表位进行了生物信息学预测,为进一步了解该蛋白的生物学功能奠定了基础.

目的 探讨法舒地尔(Fasudil)对H2O2诱导的SY5Y人神经母细胞瘤细胞凋亡和突触可塑性的影响及其机制.方法 细胞分为PBS对照组、250 μmol/L H2O2处理组和250 μmol/L H2O2联合15 μg/mL Fasudil处理组.噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡,免疫荧光细胞化学染色检测神经突生长抑制因子A(NogoA)、NogoA受体(NgR)和突触小泡蛋白(Syn)的表达,Western blot法检测NogoA、NgR、p75神经营养因子受体(p75NTR)和含富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白结构域的Nogo相互作用蛋白1(LINGO-1)、Syn和突触后致密区蛋白95(PSD-95)的表达.结果 与PBS组比较,H2O2组细胞活性降低,细胞凋亡率升高,Fasudil处理可显著提高细胞活性,降低细胞凋亡率.与H2O2模型组比较,Fasudil处理能使Syn和PSD-95的表达增加.与PBS组比较,H2O2组NogoA及其受体复合物NgR/p75NTR/LINGO-1的表达明显增加,而Fasudil处理可以抑制NogoA及其受体复合物NgR/p75NTR/LINGO-1的表达.结论 Fasudil可能通过抑制NogoA/NgR信号通路的激活,从而减轻H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡以及增强突触的可塑性.