目的:构建猪带绦虫重组质粒pET30a-富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域15（LRRC15），原核表达纯化的LRRC15重组蛋白，制备兔多克隆抗体。方法:采用全基因合成方法，获得猪带绦虫LRRC15蛋白编码基因；将其克隆至pET30a载体，构建重组质粒pET30a-LRRC15，并进行双酶切PCR鉴定；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达LRRC15重组蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析鉴定表达产物；用Ni-IDA亲和层析柱纯化LRRC15重组蛋白，SDS-PAGE进行分析鉴定；蛋白质印迹法（Western blot，WB）鉴定纯化重组蛋白特异性；用纯化的LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔，制备LRRC15多克隆抗体，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定纯化多克隆抗体的效价。结果:经PCR鉴定，扩增出长度为1 506 bp的条带，与LRRC15基因相符；经SDS-PAGE和WB鉴定，获得相对分子质量（ Mr）约为55.36 × 10 3的LRRC15目的蛋白；用LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔，获得LRRC15多克隆抗体，其效价为1∶1 587 200。 结论:成功构建重组质粒pET30a-LRRC15，制备出猪带绦虫LRRC15重组蛋白，并获得了高纯度、高效价的LRRC15重组蛋白兔抗多克隆抗体。

目的:探讨影响局部复发直肠癌（LRRC）肿瘤手术根治性和预后的相关因素。方法:采用回顾性病例对照研究。回顾性分析2009年1月至2019年8月北京大学第一医院手术治疗的LRRC患者病例资料。术前根据患者的影像检查结果对盆壁的累及情况行"北大医院F分型"，即将骨盆划分为前方、两侧盆壁和骶骨4个方向，根据盆壁累及程度分为F0（无累及盆壁，肿瘤累及临近脏器或向前方侵犯泌尿、生殖器官或小肠）、F1（肿瘤累及一个方向的盆壁，如骶骨、两侧盆壁之一）、F2（累及两个方向的盆壁）和F3（累及3个方向的盆壁）。病例纳入标准：（1）经影像学及活检病理学检查（穿刺或肠镜活检）确诊为直肠癌术后局部复发；（2）随访资料和临床资料完整；（3）获得患者的知情同意书。排除因心肺等功能不全无法耐受手术治疗、影像学检查结果提示为F3或有远处转移的患者。根据病理结果对肿瘤的手术根治性进行评价。患者术后每12个月进行随访。影响肿瘤根治性的单因素风险分析采用χ 2检验，多因素风险分析采用Logistic分析。采用Kaplan-Meier法计算生存率并绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验。应用Cox比例风险模型对于预后进行多因素回归分析。 结果:共计入组111例LRRC患者，其中男性59例，女性52例，复发年龄≥65岁者36例，癌胚抗原水平≥15 μg/L者48例。根据"北大医院F分型"结果，F0、F1和F2患者分别有70例、38例和3例。行腹会阴联合切除术28例，后盆腔脏器切除术32例，全盆腔脏器切除术51例（其中联合骶尾骨切除1例）。根据术后病理评价，R 0、R 1和R 2切除分别为83例、20例和8例。单因素分析提示，LRRC的手术根治性与LRRC手术方式、北大医院F分型以及淋巴结是否转移密切相关（均 P<0.05）。多因素分析提示，北大医院F分型为F1~2是不能完成R 0切除的独立危险因素（ OR=37.256，95% CI：8.572~161.912， P<0.001）。全组手术并发症发生率为22.5%（25/111），围手术期病死率1.8%（2/111），LRRC术后局部复发率为37.8%（42/111）。全组患者术后3年和5年生存率分别为41.2%和21.9%，其中LRRC术后化疗组与未予化疗组的3年生存率分别为52.7%与32.4%（ P=0.005）；癌胚抗原水平<15 μg/L与≥15 μg/L者的3年生存率分别为52.9%与24.3%（ P<0.001）；R 0、R 1和R 2切除患者的3年生存率分别为49.8%、21.3%和8.5%（ P=0.002）；F0、F1和F2的3年生存率分别为52.7%、22.0%和0（ P<0.001）。多因素分析提示，手术根治性（ HR=2.088，95% CI：1.095~3.979， P=0.025）、术前癌胚抗原水平（ HR=1.857，95% CI：1.157~2.980， P=0.010）和是否接受术后辅助化疗（ HR=1.826，95% CI：1.137~2.934， P=0.013）是影响LRRC患者预后的独立因素（均 P<0.05）。 结论:LRRC手术必须严格限制手术适应证。评估复发肿瘤累及盆壁的情况有利于提高手术根治性。术前较低的癌胚抗原水平、提高肿瘤手术根治性和术后辅助化疗是延长LRRC患者总生存期的关键因素。

富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat containing protein 15，LRRC15)基因编码具有15个富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)的Ⅰ型跨膜蛋白，参与多种疾病的发生与发展。既往对LRRC15基因的研究多聚焦于肿瘤疾病中的促瘤作用，其在非肿瘤疾病中的免疫调控作用仍处于探索阶段，包括控制病毒感染、参与成骨细胞及软骨细胞功能的改变、促进促炎细胞因子释放及成骨分化，以及促进成纤维细胞样滑膜细胞的增殖、迁移和血管生成等。本文总结了LRRC15基因在非肿瘤疾病中的研究现状及角色，从而揭示该基因在免疫调控中的重要作用。

目的:鉴定富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein-15，LRRC15)来源的优势细胞毒性T淋巴细胞(cytosolic T lymphocyte，CTL)表位肽，并验证其诱导CTL特异性抗乳腺癌免疫效应。方法:收集中国医科大学附属第一医院乳腺癌外科自2010年1月至2010年7月经手术病理证实的乳腺癌组织及正常组织各30例。利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库和免疫组化方法评估LRRC15在乳腺癌中表达情况。利用免疫表位数据库(Immune Epitope Database and Analysis Resource，IEDB)联合SYFPEITHI数据库预测LRRC15蛋白序列中HLA-A2.1限定性CTL表位肽。利用分子对接软件MOE、T2亲和力实验和荧光共聚焦技术确认候选CTL表位肽与HLA-A2.1分子亲和性。利用酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)以及流式细胞术检测CTL表位肽免疫活性。利用钙黄素和Dil标记乳腺癌细胞评价CTL表位肽诱导的杀伤效应。建立乳腺癌移植瘤模型进行免疫回输，在体内评估CTL表位肽诱导的抗肿瘤效应。结果:相比于正常组织，LRRC15 mRNA在乳腺癌组织中表达水平明显增高，组间差异有统计学意义[(4.00±1.57)比(1.31±0.72)， Z＝14.85， P <0.05]；LRRC15 mRNA表达与CD8 ＋T细胞浸润呈显著正相关性( r＝0.20， P<0.001)。LRRC15蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，可作为乳腺癌潜在靶点。在筛选得到的3条候选CTL表位肽中，L2与HLA-A2.1分子具有最高亲和力(FI＝2.490)。与阴性肽组相比，L2能够明显提升CD8 ＋T细胞亚群比例(27.70%比45.50%)，L2负载的树突状细胞(dendritic cells，DCs)能够明显提升CD8 ＋T细胞分泌干扰素(interferon，IFN) -γ的水平(50.20%比74.90%)。在最高效靶比时，L2诱导的效应细胞对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的杀伤效应明显高于阴性肽对照组，组间差异有统计学意义[(19.30±2.20)%比(8.60±1.40)%， t ＝1.45， P <0.05]，但对乳腺上皮细胞MCF-10A无杀伤效应( P >0.05)。L2负载DCs诱导的CTL细胞对2例乳腺癌组织来源的原代肿瘤细胞表现出明显的杀伤效应，且杀伤效应随着效靶比增高而增加。与阴性肽相比，L2诱导的CTL效应细胞使小鼠移植瘤体积明显降低[(450±110)mm 3比(725±130 )mm 3， t ＝0.36， P <0.05]，生存时间明显延长[(35±4.5)d比(29.16±1.94)d，LogRank P ＝ 0.000 ]。 结论:LRRC15来源HLA-A2.1限定性CTL表位肽L2能够在体外有效的诱导CTL免疫应答反应，并发挥抗乳腺癌效应。

目的 探讨富含亮氨酸重复序列15(LRRC15)、SUN结构域蛋白2(SUN2)在上皮性卵巢癌(EOC)组织中的表达变化及其与患者预后的关系.方法 选取102例EOC患者手术切除癌组织(观察组),以60例因卵巢良性囊肿行手术治疗的正常卵巢组织为对照组.采用免疫组化法检测癌及正常卵巢组织中LRRC15、SUN2表达.通过Spearman秩相关分析评估LRRC15与SUN2表达的相关性,采用Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归分析LRRC15、SUN2表达与EOC患者预后的关系.结果 观察组LRRC15阳性率高于对照组,SUN2阳性率低于对照组,差异有统计学意义(P均＜0.05).观察组中LRRC15与SUN2表达呈负相关(r=-0.634,P＜0.05).LRRC15在EOC患者FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移中的阳性率高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织,SUN2在EOC患者FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移中的阳性率低于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织,差异有统计学意义(P均＜0.05).LRRC15阳性组EOC患者3年总生存率低于LRRC15阴性组,SUN2阴性组EOC患者3年总生存率低于SUN2阳性组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).FIGO分期Ⅲ期、病理分级Ⅲ级、淋巴结转移、LRRC15阳性是影响EOC患者预后的危险因素,SUN2阳性是保护因素(P均＜0.05).结论 EOC患者癌组织中LRRC15表达升高、SUN2表达降低,LRRC15、SUN2表达与EOC肿瘤进展有关,检测二者水平有助于评估EOC患者预后.

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)癌症易感性基因 15(Cancer susceptibility candidate 15,CASC15)在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的分子调控机制.方法 通过生物信息学方法预测目的基因表达,并分析目的基因表达与患者生存时间的关系;收集临床HCC患者肝癌组织和癌旁组织;CCK-8、Transwell和流式细胞术实验检测HCC细胞SMMC7721 和Huh-7 的增殖、侵袭、迁移以及凋亡;双荧光素酶实验检测miR-144-3p与CASC15 和富含亮氨酸的重复序列蛋白 1(Leucine rich repeat containing protein 1,LRRC1)的靶向关系;qRT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达情况;免疫荧光实验用于蛋白定位研究;回复实验验证CASC15/miR-144-3p/LRRC1 对HCC进展的影响.体内实验验证CASC15 对HCC进展的影响.结果 TCGA数据库与qRT-PCR检测显示HCC组织和细胞中CASC15 高表达、miR-144-3p低表达、LR-RC1 高表达(P<0.05).增殖、侵袭、迁移的细胞功能实验结果表明在肿瘤发展中CASC15 和LRRC1 起到促进作用,miR-144-3p则是抑制作用,与凋亡实验结果一致(P<0.05).细胞功能实验表明CASC15 抑制miR-144-3p功能,miR-144-3p抑制LRRC1,CASC15 与miR-144-3p结合,并导致LRRC1 上调.回复实验结果表明CASC15 通过抑制miR-144-3p促进LRRC1的表达从而促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移并抑制细胞凋亡.结论 CASC15 可能通过调节miR-144-3p/LRRC1 轴,从而促进HCC进展.

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病.为探讨富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein 15,LRRC15)在IPF的作用及调节机制,本研究构建了博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化和A549细胞损伤模型,检测了 LRRC 15的表达变化.转染siLRRC15后分别采用MTT、GFP-RFP-LC3双荧光标记系统和免疫印迹等方法检测了细胞活性和自噬的变化.结果表明:BLM处理后,小鼠肺组织和A549细胞中LRRC 15表达显著上调;将设计和合成的siLRRC15转入A549细胞,LRRC 15的表达极显著降低,可以部分恢复BLM引起的细胞损伤;BLM处理A549细胞后,LC3-Ⅱ和P62蛋白呈现上升的趋势;GFP-RFP-LC3双荧光标记检测发现,BLM处理后自噬体数量明显增多;进一步用siLRRC15处理A549细胞后发现,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7的表达增加,P62蛋白表达下调,自噬流的强度增加.以上研究结果说明LRRC 15是IPF中上皮细胞损伤的指示剂,可能通过调节自噬参与纤维化过程中的调节,本研究为进一步阐明IPF的机制提供了必要的理论依据.

目的 基于机器学习筛选类风湿关节炎(RA)的诊断标志基因,并分析可能的免疫浸润机制,为RA的临床治疗提供参考.方法 从基因表达综合(GEO)数据库下载 RA 基因表达谱芯片数据集,将GSE55235 和GSE77298 作为联合芯片训练集,GSE55457 作为独立验证数据集.使用R软件进行差异表达基因(DEGs)的筛选,并对这些DEGs进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析.进一步应用三种机器学习算法筛选诊断基因,并进行外部验证和受试者工作特征(ROC)曲线分析.通过xCell算法分析免疫细胞在RA中的浸润情况.结果 筛选出RA的DEGs共 704 个.富集分析发现这些DEGs主要涉及白细胞介导的免疫、免疫应答的激活、白细胞迁移等相关免疫功能,以及趋化因子信号通路、利什曼病、类风湿关节炎等相关炎症通路.通过机器学习筛选出4 个诊断基因,包括趋化因子CXC配体13(CXCL13)、富含亮氨酸重复序列结构域15(LRRC15)、多配体蛋白聚糖-1(SDC-1)和核酸结合蛋白3(YBX3).免疫浸润分析结果显示,在RA中B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞和单核细胞的水平显著上调(P＜0.05).结论 RA的发生发展是多基因、多通路共同参与的结果,CXCL13、LRRC15、SDC-1 和YBX3 可能是诊断RA的潜在生物标志物.B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞和单核细胞可能在RA的发生中具有重要意义.

目的 探讨猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen,ESA)富含亮氨酸重复序列结构域(Leucine-rich repeat containing 15,LRRC15)蛋白对仔猪树突状细胞(Dendritic cell,DC)成熟活化的影响.方法 收集正常仔猪DC体外诱导、培养,获得成熟与未成熟DC(immature DC,imDC).在正常仔猪未成熟DC中,分别加入LRRC15蛋白、ESA刺激,将LRRC15组作为实验组;同时建立ESA对照组、LPS阳性对照组、LRRC15+LPS阳性对照组、LPS+ESA阳性对照组和培养基阴性对照组.流式细胞术检测DC表面标志物MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达量;ELISA检测DC细胞培养上清TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12的分泌水平.结果 与未刺激DC组相比,LRRC15蛋白组诱导DC表面标志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达均增加.在LPS存在情况下,LRRC15蛋白也能诱导CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子上调;ELISA检测结果显示,与1640培养基组、LPS组和ESA组相比,LRRC15蛋白组均诱导IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌 降低,LRRC15蛋白组与1640培养基组相比 IL-6(t=7.529,P＜0.05),IL-10(t=2.780,P＜0.05),IL-12(t=4.673,P＜0.05),TNF-α(t=2.894,P＜0.05);LRRC15蛋白组与 LPS 组相比 IL-6(t=26.663,P＜0.05),IL-10(t=12.038,P＜0.05),IL-12(t=27.594,P＜0.05),TNF-α(t=29.540,P＜0.05);LRRC15 蛋白组与 ESA 组相比 IL-6(t=6.343,P＜0.05),IL-10(t=2.579,P＜0.05),IL-12(t=8.102,P＜0.05),TNF-α(t=3.890,P＜0.05).ESA组与1640培养基组相比能诱导IL-12分泌(t=3.430,P＜0.05),其他细胞分子分泌水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 LRRC15蛋白能诱导DC成熟活化,并抑制DC相关细胞因子的分泌,但能否通过其他途径诱导Th细胞分化还需进一步分析.

目的 探讨原发性纤毛运动障碍(PCD)临床、纤毛结构缺陷及基因变异特点.方法 对山东大学附属省立医院小儿呼吸科2013-2016年通过支气管黏膜活检纤毛电镜诊断的3例PCD患儿采用靶向目标捕获二代测序行基因检测,分析其临床表现、纤毛结构和基因变异特点,通过关键词“PCD""gene""Chinese"对在线人类孟德尔遗传数据库、人类基因组变异数据库、PubMed和中国知网建库至2017年7月的文献进行检索,分析总结已报道的中国PCD患者基因变异的病例资料.结果 3例患儿年龄10～11岁,1男2女,均有反复呼吸道感染、慢性鼻-鼻窦炎、支气管扩张,2例伴全内脏转位.例1支气管黏膜纤毛内外动力蛋白臂缺失,LRRC6基因复合杂合变异;例2支气管黏膜纤毛内外动力蛋白臂缺失,DNAH5和DNAH 11基因杂合变异;例3支气管黏膜纤毛微管数目异常和内动力蛋白臂缺陷,CCDC39基因纯合变异.3例基因变异位点均为未报道的新变异.检索共筛选出8篇文献,共报道12例基因变异的PCD中国患者,均存在自幼反复呼吸道感染、慢性鼻-鼻窦炎、支气管扩张,其中合并右位心9例.4例进行了有效的鼻(或支气管)黏膜纤毛活检,纤毛内外动力蛋白臂缺失1例,内动力蛋白臂和放射辐缺失1例,外周微管对和中央微管对部分缺失1例,纤毛结构正常1例.共发现PCD相关致病基因变异8种,DNAH5基因变异3例,DYX1C1基因变异2例,CCNO基因变异2例,CCDC39、CCDC40、HYDIN、ARMC4、DNAI1基因变异各1例.结论 PCD临床表现为自幼反复呼吸道感染、慢性鼻-鼻窦炎、支气管扩张.15例发现基因变异的中国PCD患者中11例为Kartagener综合征患者,纤毛结构可有内外动力蛋白臂、放射辐、外周微管对及中央微管对的缺陷,15例共发现10种PCD相关致病基因变异:DNAH5、DYX1C1、CCNO、CCDC39、CCDC40、HYDIN、ARMC4、DNAI1、LRRC6、DNAH11.