目的:构建猪带绦虫重组质粒pET30a-富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域15（LRRC15），原核表达纯化的LRRC15重组蛋白，制备兔多克隆抗体。方法:采用全基因合成方法，获得猪带绦虫LRRC15蛋白编码基因；将其克隆至pET30a载体，构建重组质粒pET30a-LRRC15，并进行双酶切PCR鉴定；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达LRRC15重组蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析鉴定表达产物；用Ni-IDA亲和层析柱纯化LRRC15重组蛋白，SDS-PAGE进行分析鉴定；蛋白质印迹法（Western blot，WB）鉴定纯化重组蛋白特异性；用纯化的LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔，制备LRRC15多克隆抗体，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定纯化多克隆抗体的效价。结果:经PCR鉴定，扩增出长度为1 506 bp的条带，与LRRC15基因相符；经SDS-PAGE和WB鉴定，获得相对分子质量（ Mr）约为55.36 × 10 3的LRRC15目的蛋白；用LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔，获得LRRC15多克隆抗体，其效价为1∶1 587 200。 结论:成功构建重组质粒pET30a-LRRC15，制备出猪带绦虫LRRC15重组蛋白，并获得了高纯度、高效价的LRRC15重组蛋白兔抗多克隆抗体。

富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat containing protein 15，LRRC15)基因编码具有15个富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)的Ⅰ型跨膜蛋白，参与多种疾病的发生与发展。既往对LRRC15基因的研究多聚焦于肿瘤疾病中的促瘤作用，其在非肿瘤疾病中的免疫调控作用仍处于探索阶段，包括控制病毒感染、参与成骨细胞及软骨细胞功能的改变、促进促炎细胞因子释放及成骨分化，以及促进成纤维细胞样滑膜细胞的增殖、迁移和血管生成等。本文总结了LRRC15基因在非肿瘤疾病中的研究现状及角色，从而揭示该基因在免疫调控中的重要作用。

目的:鉴定富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein-15，LRRC15)来源的优势细胞毒性T淋巴细胞(cytosolic T lymphocyte，CTL)表位肽，并验证其诱导CTL特异性抗乳腺癌免疫效应。方法:收集中国医科大学附属第一医院乳腺癌外科自2010年1月至2010年7月经手术病理证实的乳腺癌组织及正常组织各30例。利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库和免疫组化方法评估LRRC15在乳腺癌中表达情况。利用免疫表位数据库(Immune Epitope Database and Analysis Resource，IEDB)联合SYFPEITHI数据库预测LRRC15蛋白序列中HLA-A2.1限定性CTL表位肽。利用分子对接软件MOE、T2亲和力实验和荧光共聚焦技术确认候选CTL表位肽与HLA-A2.1分子亲和性。利用酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)以及流式细胞术检测CTL表位肽免疫活性。利用钙黄素和Dil标记乳腺癌细胞评价CTL表位肽诱导的杀伤效应。建立乳腺癌移植瘤模型进行免疫回输，在体内评估CTL表位肽诱导的抗肿瘤效应。结果:相比于正常组织，LRRC15 mRNA在乳腺癌组织中表达水平明显增高，组间差异有统计学意义[(4.00±1.57)比(1.31±0.72)， Z＝14.85， P <0.05]；LRRC15 mRNA表达与CD8 ＋T细胞浸润呈显著正相关性( r＝0.20， P<0.001)。LRRC15蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，可作为乳腺癌潜在靶点。在筛选得到的3条候选CTL表位肽中，L2与HLA-A2.1分子具有最高亲和力(FI＝2.490)。与阴性肽组相比，L2能够明显提升CD8 ＋T细胞亚群比例(27.70%比45.50%)，L2负载的树突状细胞(dendritic cells，DCs)能够明显提升CD8 ＋T细胞分泌干扰素(interferon，IFN) -γ的水平(50.20%比74.90%)。在最高效靶比时，L2诱导的效应细胞对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的杀伤效应明显高于阴性肽对照组，组间差异有统计学意义[(19.30±2.20)%比(8.60±1.40)%， t ＝1.45， P <0.05]，但对乳腺上皮细胞MCF-10A无杀伤效应( P >0.05)。L2负载DCs诱导的CTL细胞对2例乳腺癌组织来源的原代肿瘤细胞表现出明显的杀伤效应，且杀伤效应随着效靶比增高而增加。与阴性肽相比，L2诱导的CTL效应细胞使小鼠移植瘤体积明显降低[(450±110)mm 3比(725±130 )mm 3， t ＝0.36， P <0.05]，生存时间明显延长[(35±4.5)d比(29.16±1.94)d，LogRank P ＝ 0.000 ]。 结论:LRRC15来源HLA-A2.1限定性CTL表位肽L2能够在体外有效的诱导CTL免疫应答反应，并发挥抗乳腺癌效应。

目的 探讨富含亮氨酸重复序列15(LRRC15)、SUN结构域蛋白2(SUN2)在上皮性卵巢癌(EOC)组织中的表达变化及其与患者预后的关系.方法 选取102例EOC患者手术切除癌组织(观察组),以60例因卵巢良性囊肿行手术治疗的正常卵巢组织为对照组.采用免疫组化法检测癌及正常卵巢组织中LRRC15、SUN2表达.通过Spearman秩相关分析评估LRRC15与SUN2表达的相关性,采用Kaplan-Meier生存曲线和Cox回归分析LRRC15、SUN2表达与EOC患者预后的关系.结果 观察组LRRC15阳性率高于对照组,SUN2阳性率低于对照组,差异有统计学意义(P均＜0.05).观察组中LRRC15与SUN2表达呈负相关(r=-0.634,P＜0.05).LRRC15在EOC患者FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移中的阳性率高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织,SUN2在EOC患者FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移中的阳性率低于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织,差异有统计学意义(P均＜0.05).LRRC15阳性组EOC患者3年总生存率低于LRRC15阴性组,SUN2阴性组EOC患者3年总生存率低于SUN2阳性组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).FIGO分期Ⅲ期、病理分级Ⅲ级、淋巴结转移、LRRC15阳性是影响EOC患者预后的危险因素,SUN2阳性是保护因素(P均＜0.05).结论 EOC患者癌组织中LRRC15表达升高、SUN2表达降低,LRRC15、SUN2表达与EOC肿瘤进展有关,检测二者水平有助于评估EOC患者预后.

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)癌症易感性基因 15(Cancer susceptibility candidate 15,CASC15)在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的分子调控机制.方法 通过生物信息学方法预测目的基因表达,并分析目的基因表达与患者生存时间的关系;收集临床HCC患者肝癌组织和癌旁组织;CCK-8、Transwell和流式细胞术实验检测HCC细胞SMMC7721 和Huh-7 的增殖、侵袭、迁移以及凋亡;双荧光素酶实验检测miR-144-3p与CASC15 和富含亮氨酸的重复序列蛋白 1(Leucine rich repeat containing protein 1,LRRC1)的靶向关系;qRT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达情况;免疫荧光实验用于蛋白定位研究;回复实验验证CASC15/miR-144-3p/LRRC1 对HCC进展的影响.体内实验验证CASC15 对HCC进展的影响.结果 TCGA数据库与qRT-PCR检测显示HCC组织和细胞中CASC15 高表达、miR-144-3p低表达、LR-RC1 高表达(P<0.05).增殖、侵袭、迁移的细胞功能实验结果表明在肿瘤发展中CASC15 和LRRC1 起到促进作用,miR-144-3p则是抑制作用,与凋亡实验结果一致(P<0.05).细胞功能实验表明CASC15 抑制miR-144-3p功能,miR-144-3p抑制LRRC1,CASC15 与miR-144-3p结合,并导致LRRC1 上调.回复实验结果表明CASC15 通过抑制miR-144-3p促进LRRC1的表达从而促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移并抑制细胞凋亡.结论 CASC15 可能通过调节miR-144-3p/LRRC1 轴,从而促进HCC进展.

目的 基于机器学习筛选类风湿关节炎(RA)的诊断标志基因,并分析可能的免疫浸润机制,为RA的临床治疗提供参考.方法 从基因表达综合(GEO)数据库下载 RA 基因表达谱芯片数据集,将GSE55235 和GSE77298 作为联合芯片训练集,GSE55457 作为独立验证数据集.使用R软件进行差异表达基因(DEGs)的筛选,并对这些DEGs进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析.进一步应用三种机器学习算法筛选诊断基因,并进行外部验证和受试者工作特征(ROC)曲线分析.通过xCell算法分析免疫细胞在RA中的浸润情况.结果 筛选出RA的DEGs共 704 个.富集分析发现这些DEGs主要涉及白细胞介导的免疫、免疫应答的激活、白细胞迁移等相关免疫功能,以及趋化因子信号通路、利什曼病、类风湿关节炎等相关炎症通路.通过机器学习筛选出4 个诊断基因,包括趋化因子CXC配体13(CXCL13)、富含亮氨酸重复序列结构域15(LRRC15)、多配体蛋白聚糖-1(SDC-1)和核酸结合蛋白3(YBX3).免疫浸润分析结果显示,在RA中B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞和单核细胞的水平显著上调(P＜0.05).结论 RA的发生发展是多基因、多通路共同参与的结果,CXCL13、LRRC15、SDC-1 和YBX3 可能是诊断RA的潜在生物标志物.B细胞、CD4+T细胞、树突状细胞和单核细胞可能在RA的发生中具有重要意义.

目的 探讨猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen,ESA)富含亮氨酸重复序列结构域(Leucine-rich repeat containing 15,LRRC15)蛋白对仔猪树突状细胞(Dendritic cell,DC)成熟活化的影响.方法 收集正常仔猪DC体外诱导、培养,获得成熟与未成熟DC(immature DC,imDC).在正常仔猪未成熟DC中,分别加入LRRC15蛋白、ESA刺激,将LRRC15组作为实验组;同时建立ESA对照组、LPS阳性对照组、LRRC15+LPS阳性对照组、LPS+ESA阳性对照组和培养基阴性对照组.流式细胞术检测DC表面标志物MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达量;ELISA检测DC细胞培养上清TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12的分泌水平.结果 与未刺激DC组相比,LRRC15蛋白组诱导DC表面标志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达均增加.在LPS存在情况下,LRRC15蛋白也能诱导CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子上调;ELISA检测结果显示,与1640培养基组、LPS组和ESA组相比,LRRC15蛋白组均诱导IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌 降低,LRRC15蛋白组与1640培养基组相比 IL-6(t=7.529,P＜0.05),IL-10(t=2.780,P＜0.05),IL-12(t=4.673,P＜0.05),TNF-α(t=2.894,P＜0.05);LRRC15蛋白组与 LPS 组相比 IL-6(t=26.663,P＜0.05),IL-10(t=12.038,P＜0.05),IL-12(t=27.594,P＜0.05),TNF-α(t=29.540,P＜0.05);LRRC15 蛋白组与 ESA 组相比 IL-6(t=6.343,P＜0.05),IL-10(t=2.579,P＜0.05),IL-12(t=8.102,P＜0.05),TNF-α(t=3.890,P＜0.05).ESA组与1640培养基组相比能诱导IL-12分泌(t=3.430,P＜0.05),其他细胞分子分泌水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 LRRC15蛋白能诱导DC成熟活化,并抑制DC相关细胞因子的分泌,但能否通过其他途径诱导Th细胞分化还需进一步分析.

目的 探讨shRNA干扰富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达对结直肠癌肿瘤干细胞(CSCs)恶性行为的影响及其作用机制.方法 采用实验研究方法.流式细胞术分选Lgr5+结直肠癌CSCs,转染shLgr5慢病毒载体设为实验组;转染相应对照病毒,设为对照组.流式细胞术检测Lgr5+细胞比例,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Lgr5 mRNA的相对表达量;成球实验检测细胞自我更新能力变化;平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验分别检测体内外成瘤能力变化;qRT-PCR检测细胞中干细胞基因(Oct4、Sox2、Nanog、KLF4)、CSCs基因(CD133、CD44、ALDH)及Wnt/β-catenin信号通路关键基因(Axin2、Wnt5a、Wnt3a、Fzd3、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1) mRNA表达变化.正态分布的计量资料以-x±s表示,组间比较采用t检验.结果 (1) shRNA慢病毒介导转染效率,流式细胞术检测结果显示:实验组Lgr5+细胞为6.8％±1.0％,对照组为92.7％±3.3％,两组比较,差异有统计学意义(t=43.148,P＜0.05).qRT-PCR检测两组CSCs中Lgr5 mRNA相对表达量:实验组和对照组分别为0.168±0.057和1.148±0.004,两组比较,差异有统计学意义(t=28.778,P＜0.05).(2) Lgr5下调对结直肠癌CSCs成球和成瘤能力的影响,成球实验结果显示:实验组和对照组成球数量分别为(29±6)个和(410±10)个,两组比较,差异有统计学意义(t=41.070,P＜0.05).平板克隆成瘤实验结果显示:实验组和对照组克隆成瘤数量分别为(72±4)个和(412±19)个,两组比较,差异有统计学意义(t=31.433,P＜0.05).裸鼠皮下成瘤实验结果显示:实验组和对照组裸鼠肿瘤体积分别为(81±15)mm3和(328±24) mm3,两组比较,差异有统计学意义(t=11.304,P＜0.05).(3) Lgr5下调对相关基因的影响,qRT-PCR检测结果显示:①实验组结直肠癌CSCs中干细胞基因Oct4、Sox2、Nanog、KLF4 mRNA的相对表达量分别为0.377±0.093、0.662±0.104、3.591±0.300、0.425±0.091;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为1.957±0.026、2.137±0.015、5.831±0.165、1.536±0.014;两组上述指标比较,差异均有统计学意义(t=23.079,22.261,8.446,19.186,P＜0.05).②实验组结直肠癌CSCs中CSCs基因CD133、CD44、ALDH mRNA相对表达量分别为1.490±0.155、5.535±0.487、1.640±0.039;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为2.488±0.061、9.908±0.332、5.718±0.292;两组上述指标比较,差异均有统计学意义(t=8.170,9.667,27.849,P＜0.05).③实验组结直肠癌CSCs中Wnt/β-catenin通路相关基因Axin2、Wnt5a、Wnt3a、Fzd3、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1 mRNA相对表达量分别为1.592±0.267、0.528±0.138、2.153±0.078、1.480±0.064、0.248±0.128、1.492±0.025、0.658±0.095、1.647±0.087;对照组结直肠癌CSCs中上述基因mRNA的相对表达量分别为3.651±0.224、2.570±0.093、2.301±0.157、1.636±0.058、1.415±0.080、2.610±0.159、2.480±0.123、3.432±0.273;两组结直肠癌CSCs中Axin2、Wnt5a、c-myc、VEGF、Ascl2、claudin-1比较,差异均有统计学意义(t=7.316,15.332,12.649,12.320,14.831,9.063,P＜0.05).两组结直肠癌CSCs中Wnt3a、Fzd3比较,差异均无统计学意义(t=2.887,2.242,P＞0.05).结论 shRNA干扰结直肠癌CSCs中Lgr5表达后,细胞的恶性行为受到抑制,这种作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路活性发挥生物学效应.

富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶(LRR-RLK)在植物生长发育、病原防御以及环境适应等多个方面发挥重要作用.为了研究菘蓝(Isatis tinctoria)中LRR-RLK的表达特征,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆菘蓝LRR-RLK编码基因IiLTK的全长cDNA,并获得其基因组DNA序列.IiLTK基因全长cDNA为2 477 bp(GenBank登录号DQ211577),包含1个2 160 bp的开放阅读框(ORF),编码719个氨基酸残基.对应的基因组分析表明,IiLTK基因含15个内含子和16个外显子.通过qRT-PCR检测IiLTK在四倍体和二倍体菘蓝的不同器官中及受到不同胁迫条件下的表达情况:IiLTK基因在2种倍性菘蓝的根、茎和叶中均有表达,且四倍体菘蓝根和叶中的表达水平均显著高于二倍体.赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)处理能显著提高IiLTK的表达水平;高盐(NaCl)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理显著降低IiLTK的表达水平;低温(4℃)和水杨酸(SA)处理对IiLTK表达水平影响不大.

目的 对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中差异表达蛋白富含亮氨酸重复序列结构域15(leucine-rich repeat containing 15,LRRC15)进行真核表达,并预测其抗原表位.方法 通过在线软件ExPASy-PortParam和Protean软件预测LRRC15蛋白分子质量、稳定性、氨基酸序列组成及等电点和T淋巴细胞抗原表位.采用基于PCR的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)技术设计全长拼接引物,合成LRRC15基因.构建重组质粒pcDNA3.4-LRRC15并转染至人胚胎肾细胞HEK293,表达LRRC15蛋白,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blotting)鉴定.结果 成功构建了重组质粒pcDNA3.4-LRRC15,表达分子质量约70 kDa的LRRC15目的蛋白.经ExPASy-PortParam软件预测,LRRC15属于亲水性蛋白,由644个氨基酸组成,分子质量为69.89 kDa,等电点为5.6;蛋白分子式为C3073H4942N846O953S28,不稳定系数为50.3,为一种不稳定蛋白.采用Protean软件预测发现,LRRC15蛋白位于292～295、353～361、521～526、555～564位氨基酸区段具有T细胞抗原表位优势,具有亲水性高、柔韧性好、表面可及性大、抗原性指数高的表位位于122～131、216～233、249～254、333～343、358～361、368～372、384～386、407～412、445～450、469～481、553～564、588～594、607～617、624～639位氨基酸区段.将重组质粒pcDNA3.4-LRRC 15转染至HEK293细胞后,SDS-PAGE和Western blotting分析发现,在细胞分泌培养基、细胞裂解上清和沉淀中检测到LRRC15蛋白.从细胞培养基中纯化出LRRC15-His融合蛋白,SDS-PAGE显示在分子质量约为70 kDa处出现明显条带,Western blotting能够识别LRRC15重组蛋白条带.结论 成功对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中的LRRC15蛋白进行真核表达,并对其抗原表位进行了生物信息学预测,为进一步了解该蛋白的生物学功能奠定了基础.