目的:运用单细胞转录组测序分析牙周炎小鼠脑膜的生物学改变，探讨牙周炎小鼠脑膜生物学改变与认知障碍的相关性。方法:将30只C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为2组（每组15只），在对照组小鼠上颌双颊侧局部涂抹不含牙龈卟啉单胞菌（Pg）的2%羧甲基纤维素（CMC），在实验组小鼠上颌双颊侧局部涂抹Pg W83和2%CMC的混合物，3次/周，持续16周。观察对照组和实验组小鼠上颌牙槽骨吸收情况、自主活动能力与认知功能的变化、大脑皮层中小胶质细胞和星形胶质细胞激活情况、检测小鼠脑膜和大脑内紧密连接蛋白Occludin mRNA表达情况。然后使用统一流形逼近与投影（UMAP）算法对单细胞转录组各细胞亚群数据进行降维整合处理。对内皮细胞差异基因进行基因本体（GO）和京都基因和基因组数据库（KEGG）富集分析，进一步采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证差异基因转录激活因子3（Atf3）、含载脂蛋白L域1（Apold1）的表达情况。结果:亚甲蓝染色实验显示，实验组小鼠上颌颊、腭侧釉质牙骨质界到牙槽嵴顶的距离［分别为（185.60±17.60）、（206.90±13.37）μm］均显著大于对照组［分别为（135.33±9.57）、（163.05±14.98）μm］（ t=5.02， P=0.002； t=4.37， P=0.005）。旷场实验显示实验组小鼠的总路程和平均速度［（971.88±164.57）cm和（3.25±0.55）cm/s］与对照组［（914.24±278.81）cm和（3.05±0.93）cm/s］相比差异均无统计学意义（ t=0.65， P=0.525； t=0.65， P=0.520）。新物体识别实验中实验组小鼠相对辨别指数［（48.02±16.92）%］显著低于对照组［（66.27±17.90）%］（ t=2.40， P=0.027）。Y迷宫实验显示，实验组小鼠的自发交替率［（50.99±14.17）%］显著低于对照组［（63.56±11.88）%］（ t=2.33， P=0.030）。免疫组化染色结果显示，实验组小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞被激活。RT-qPCR结果显示，实验组小鼠脑膜和大脑中紧密连接蛋白Occludin mRNA的表达（分别为0.61±0.10、0.64±0.20）均显著低于对照组（分别为1.02±0.25、1.04±0.31）（ t=3.47， P=0.010； t=2.66， P=0.024）。单细胞转录组测序显示，脑膜存在11种细胞类型，包括内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等，其中内皮细胞占比最大［对照组为26.47%（1 589/6 004），实验组为26.26%（807/3 073）］，是脑膜中最主要的细胞类型；实验组小鼠脑膜组织中粒细胞比例［11.65%（358/3 073）］较对照组［5.56%（334/6 004）］增加。进一步聚类分析内皮细胞，GO富集分析显示差异基因与血管生成、细胞黏附、细胞凋亡等有关；KEGG分析显示差异基因与白细胞介素-17信号通路、松弛素信号通路等相关。RT-qPCR显示，实验组小鼠脑膜组织中Atf3和Apold1 mRNA表达（分别为0.42±0.24、0.54±0.27）均显著低于对照组（分别为1.03±0.26、1.02±0.23）（ t=3.88， P=0.005； t=3.02， P=0.017）。 结论:Pg W83慢性感染的牙周炎小鼠认知能力下降，存在神经炎症，屏障功能改变；单细胞转录组测序发现脑膜组织存在免疫细胞浸润，Atf3和Apold1基因表达下调，提示脑膜免疫和屏障功能的改变在牙周炎导致的认知障碍中发挥作用。

目的:探究 TARDNA 结合蛋白-43(TARDNA binding protein-43,TDP-43)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的炎症微环境中小鼠牙龈成纤维细胞(mouse gingival fibroblasts cells,MGFs)的影响.方法:分离培养野生型C57BL/6J小鼠的牙龈成纤维细胞.设置不同浓度及处理时间的LPS刺激,通过实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测相关炎症因子的mRNA表达量,筛选出最佳处理条件.对细胞进行免疫荧光染色,观察炎症微环境下MGFs中TDP-43的变化.使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染技术敲低MGFs中的TDP-43,并测定转染效率.设置3个实验组:阴性对照组(NC组)、LPS诱导对照组(NL组)和TDP-43敲低+LPS诱导组(SL组).利用RT-qPCR技术检测部分炎症因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、黏附相关因子mRNA的表达情况.应用蛋白质印迹法(western blotting)检测部分炎症因子、黏附相关因子蛋白表达情况.使用天狼星红染色法探究细胞内胶原沉积情况.结果:最佳LPS刺激的浓度为100 ng/mL,时间为6 h;在无LPS刺激的状态下,MGFs中的TDP-43基本在细胞核内,LPS刺激后,TDP-43出现在细胞核和细胞质中;成功使用siRNA转染MGFs构建敲低TDP-43的细胞模型,转染效率接近50％;在LPS刺激下,TDP-43敲低的实验组(SL组)与对照实验组(NL组)相比,炎症因子、基质金属蛋白酶、黏附相关因子mRNA的表达量出现下调(P＜0.05),且部分黏附相关蛋白及炎症因子蛋白的表达量也显著下调;在胶原沉积方面,SL组和NL组相较于NC组都有减少(P＜0.05),但NL组和SL组差异不大,无统计学意义(P＞0.05).结论:当LPS诱导MGFs处于炎症微环境时,TDP-43出现由核内向核外移动的趋势;且TDP-43对LPS诱导的MGFs炎症微环境下炎症因子、黏附相关因子及基质金属蛋白酶表达起正向调控作用,对胶原沉积的影响不明显.

目的 探讨两种代谢法荧光探针对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)的影响,并比较两种荧光探针标记的Pg在小动物活体成像中的应用效果.方法 本研究通过单位伦理委员会审查及单位实验生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准.Pg通过生物正交反应整合四酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺(N-azidoacetylgalactosamine,Ac4GalNAz),再通过点击化学反应实现了Cy5-二苯并环辛炔(Cy5-Dibenzocy-clooctyne,Cy5-DBCO)、Cy7-DBCO标记.根据细菌不同标记状态进行分组:Pg组(对照,未经荧光标记的Pg)、Cy5-Pg组(Cy5-DBCO标记的Pg)、Cy7-Pg组(Cy7-DBCO标记的Pg).细菌活死染色试剂盒检测Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg的活性;Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg分别刺激人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)后检测HGF白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8的mRNA水平和HGF增殖能力;与大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)共培养检测荧光标记的Pg的稳定性;用小动物活体成像系统(in vivo imaging system,IVIS)检测系列浓度梯度的Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度.最后,将Cy5-Pg、Cy7-Pg分别经口灌饲给C57BL/6J小鼠,IVIS分别检测Cy5或Cy7信号强度,计算信噪比.结果 代谢法可以被应用于活的Pg的荧光标记,Cy5、Cy7标记Pg的最佳浓度分别为20 μmol/L、30 μmol/L.Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg中活死细菌所占面积比值分别为1.86、1.85、1.88(F=0.318,P＞0.05).Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg刺激HGF 6 h后,HGF的IL-6、IL-8 mRNA水平分别比Ctrl组(无细菌刺激组)升高了7.86、7.46、6.56倍(IL-6,F=40.886,P＜0.001)和12.43、13.03、13.71倍(IL-8,F=18.781,P＜0.01),3个实验组间无明显差异(P＞0.05).Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg以不同MOI(multiplicity of infection)刺激HGF,与Ctrl组(无细菌刺激组)相比,HGF的增殖能力均显著下降(MOI=104∶1,F=153.52,P＜0.001;MOI=105∶1,F=331.21,P＜0.001;MOI=106∶1,F=533.65,P＜0.001),3个实验组间差异无统计学意义(P＞0.05).Cy5-Pg或Cy7-Pg与E.coli共培养的24 h内,仅有非常少的E.coli被标记上荧光,且3 h内荧光强度几乎无衰减.Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度与浓度呈正线性相关(R2=0.97).Cy5-Pg或Cy7-Pg灌饲至小鼠体内后,在1 h、3 h时,Cy7-Pg在小鼠腹部成像的信噪比分别为Cy5-Pg的4.24倍(t=6.893,P＜0.01)、3.77倍(t=4.407,P＜0.05);Cy7-Pg在分离出的胃肠道内成像的信噪比为Cy5-Pg的5.19倍(t=4.418,P＜0.05).结论 代谢法荧光标记不影响Pg的活性、免疫调节能力和毒性.在小动物活体成像中Cy7具有比Cy5更好的成像效果,为研究牙周炎和全身疾病的联系提供了实验基础.

目的 通过体内外实验探索大麻二酚(CBD)联合米诺环素(MINO)对小鼠实验性牙周炎的治疗作用.方法 丝线结扎法建立小鼠牙周炎模型,口腔局部分别给予CBD、MINO及二者联用,通过定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测牙周炎小鼠用药后外周血炎症因子变化,Micro CT、免疫印迹(WB)及苏木精-伊红(HE)染色分析局部位点炎症改善情况;牙龈卟啉单胞菌抑菌实验检测联用药物体外抗菌性能;体外诱导巨噬细胞及牙龈成纤维细胞炎症,通过qRT-PCR检测炎症相关mRNA表达,划痕实验探索药物对细胞迁移的影响,并通过酶联免疫吸附(ELISA)测定探究药物对于胶原生成的作用.结果 联用CBD与MINO后,与单独用药相比,小鼠全身炎症指标下降,局部附着丧失减轻、组织炎症水平降低、牙周软硬组织破坏得到改善;体外抑菌实验结果表明联用药物表现出良好的抗菌性能;体外细胞实验证明联用药物降低巨噬细胞多种炎症因子的表达水平,促进炎症状态下人牙龈成纤维细胞增殖、迁移,提升胶原形成功能.结论 相较单一用药方式法,局部应用CBD联合MINO对小鼠实验性牙周炎有着显著疗效.

目的 研究芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.g-LPS)诱导的牙周膜成纤维细胞Nlrp3-in-flammasome活化的影响.方法 体外培养牙周膜成纤维细胞,采用P.g-LPS作为刺激剂,通过Western blot观察不同浓度芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)对Nlrp3、前体caspase-1(pro-caspase-1)、活化caspase-1(cle-caspase-1)、TXNIP蛋白表达量的影响分子活化程度,利用RT-qPCR方法检测其对前体caspase-1、Nlrp3转录水平的影响,并使用荧光探针法评价对ROS生成量的影响.结果 与空白对照相比,给予P.g-LPS刺激的小鼠牙周膜成纤维细胞Nlrp3、前体caspase-1、TXNIP的蛋白表达量及ROS的生成量明显增高,活化caspase-1的生成明显增多,AE可以明显降低Nlrp3、前体caspase-1,活化caspase-1,TXNIP在细胞内的蛋白表达量,同时抑制Nlrp3和前体caspase-1的转录水平并且减少ROS在细胞内的生成量.结论 AE能通过抑制Nlrp3相关蛋白的表达及减弱ROS/TXNIP诱导的Nlrp3-inflammasome聚集明显抑制P.g-LPS诱导的小鼠牙周膜成纤维细胞Nlrp3-inflam-masome的活化.

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的耐受对小鼠腹腔巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1和MMP-7的影响,以及耐受巨噬细胞对小鼠成纤维细胞L929迁移能力的影响.方法:采用1μg/mL P.gingivalis LPS重复刺激小鼠腹腔巨噬细胞,构建内毒素耐受模型,并以1μg/mL大肠杆菌(Escherichia coli E.coli LPS作为阳性对照.收集细胞条件培养液上清,采用ELISA技术检测MMP-1和MMP-7表达水平.观察耐受巨噬细胞条件培养液对L929细胞划痕创伤构建后细胞迁移能力的影响.结果:P.gingivalis LPS重复刺激后,巨噬细胞MMP-1分泌水平较单次刺激组降低(P＜0.05),MMP-7分泌水平无明显变化(P＞0.05).P.gingivalis LPS诱导的耐受巨噬细胞培养液上清刺激12、24 h后,L929细胞划痕修复面积大于单次刺激组培养液上清刺激后(P＜0.05).结论:P.gin-givalisLPS诱导的耐受能抑制小鼠腹腔巨噬细胞分泌MMP-1,促进L929细胞迁移.

目的:研究一种经聚多巴胺(PDA)改性后的纳米氧化锌(nano-ZnO-PDA)对体外龈下菌斑中细菌的抑制效果,与口腔中常用的普通氧化锌(ZnO)做对比,并探讨nano-ZnO-PDA的生物安全性.方法:利用水浴法合成直径为50 nm左右的球状na-no-ZnO(nano-ZnO组),经盐酸多巴胺(DA)在弱碱条件下发生自聚作用,产生PDA包裹在球状nano-ZnO上,形成nano-ZnO-PDA(nano-ZnO-PDA组),透射电镜观察改性前、后的纳米结构变化,检测其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的体外抗菌效果:并与口腔治疗中常用的ZnO(ZnO组)做对比;同时,检测这3种ZnO对人成纤维细胞的毒性以及进行小鼠灌胃实验以进一步验证该材料对小鼠的组织毒性.结果:nano-ZnO以及nano-ZnO-PDA的抗菌效果优于普通ZnO(P＜0.05),对于牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌,nano-ZnO与nano-ZnO-PDA比较,差异有统计学意义(P＜0.05).na-no-ZnO-PDA的体外细胞毒性低于普通ZnO和nano-ZnO(P＜0.05),3种ZnO对小鼠的体内组织没有产生明显的毒性作用.结论:nano-ZnO-PDA对龈下菌斑中的体外抗菌效果优于普通ZnO,且对人成纤维细胞和小鼠组织并未表现出明显的毒性作用.

目的 探讨miRNA-146a在牙周组织的表达及其抗炎作用机制.方法 收集小鼠牙龈成纤维细胞和腹腔巨噬细胞,采用Transwell法将2 μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激24 h的巨噬细胞与牙龈成纤维细胞共培养.分析LPS诱导对牙龈成纤维细胞和巨噬细胞miRNA-146a表达的影响,以及miRNA-146a对巨噬细胞炎症因子、白介素-1 受体相关激酶1(interleukin-1 receptor associated kinase 1,IRAK1)、TNF受体关联因子6(tnf receptor associated factor 6,TRAF6)表达和c-Jun N端激酶(c-jun n-terminal kinase,JNK)磷酸化水平的影响.采用SPSS 20.0软件包进行数据分析.结果 LPS刺激24h后,牙龈成纤维细胞和巨噬细胞miRNA-146a表达水平显著升高(P＜0.05);LPS刺激巨噬细胞源性上清液可诱导牙龈成纤维细胞mniRNA-146a表达增加(P＜0.05);LPS刺激24h后,miRNA-146a mimic转染的巨噬细胞IL-1β mRNA和MCP-1 mRNA表达水平显著低于转染miRNA-146a count的细胞(P＜0.05),TNF-α mRNA表达水平降低,但差异无统计学意义(P＞0.05);LPS刺激4h后,miRNA-146a mimic转染的巨噬细胞IRAK1和TRAF6表达水平显著低于转染miRNA-146a count的细胞(P＜0.05);LPS刺激90min后,miRNA-146a mimic转染的巨噬细胞p-JNK水平显著低于转染miRNA-146a count的细胞(P＜0.05).结论miRNA-146a可通过下调IRAK1和TRAF6表达水平、减少JNK磷酸化,抑制巨噬细胞源性炎症因子的产生,有可能成为慢性牙周炎的潜在治疗分子.

背景:临床上常采用引导骨再生技术对骨缺损部位进行重建,即在骨缺损处植入支架材料,再采用生物屏障膜建立稳定的成骨环境,保证成骨细胞的增殖及血管的形成,取得了良好的效果.目的:观察煅烧骨结合脱细胞真皮基质用于拔牙窝填充的成骨效果.方法:采用高温煅烧法将牛松质骨制成煅烧骨,采用去表皮、脱细胞等方法将猪断层皮片制成脱细胞真皮基质,MTT法检测两种材料的细胞毒性.取9只比格犬,拔除下颚两侧第2,4前磨牙,拔牙窝内植入煅烧骨后用脱细胞真皮基质覆盖,分离颊舌侧牙龈并拉拢缝合,关闭拔牙创.术后1,3,6个月,采用锥形束CT、X射线片及组织学观察等方法评价成骨效果.实验由中国辐射防护研究院药物安全性评价中心伦理委员会审批,编号CIRP-IACUC-(R)2018081.结果 与结论:①两种材料浸提液分别培养L929小鼠成纤维细胞24 h后,倒置显微镜下可见细胞形态良好,无空泡、死亡现象,MTT法结果显示细胞存活率均在85％以上,无明显的细胞毒性;②动物实验下颌骨锥形束CT检测显示,随着愈合时间延长,植入部位的相对灰度值逐渐增高,拔牙创内的成骨量增加;③动物实验X射线片显示,术后1个月,植入部位成像均匀、无明显成骨;术后3个月,植入部位有部分成骨;术后6个月,植入部位有明显成骨;④动物实验苏木精-伊红染色显示,术后1个月,拔牙窝内有大量新形成的骨小梁结构,骨小梁排列均匀,煅烧骨部分被吸收;术后3个月,见粗大骨小梁结构,伴有大量软骨,残留少量的煅烧骨;术后6个月,拔牙创接近愈合,形成成熟骨组织,可见骨单元结构,已观察不到煅烧骨;⑤结果表明,煅烧骨复合脱细胞真皮基质用于拔牙窝的填充具有良好的成骨效果.

目的:研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas lipopolysaccharide,LPS-PG)对牙周膜成纤维细胞(mouse periodontal Lig-ament:Normal Fibroblasts,mPDLFs)增殖及迁移的影响,探讨TXNIP/Nlrp3炎性体途径在其中的作用.方法:采用不同浓度的LPS-PG刺激小鼠mPDLFs细胞不同时间,CCK-8法检测细胞增殖抑制率.然后将细胞分为对照组(培养基作用24h)和LPS-PG组(2 M的LPS-PG作用24 h),划痕实验检测细胞迁移,ELISA法检测白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMGB1)的水平,Western Blot 检测 Nod 样受体蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain3,NL-RP3)、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、活化半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase-1)和硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的表达,免疫共沉淀检测以上蛋白间的相互作用.结果:与0 M的LPS-PG相比,1M和2 M的LPS-PG可显著增加mPDLFs的细胞增殖抑制率(P＜0.05).与LPS-PG作用0h相比,LPS-PG作用12h、24h和48 h均可显著增加mPDLFs的细胞增殖抑制率(P＜0.05).LPS-PG组细胞向中间＇伤口,迁移的距离及细胞数量远远低于对照组.与对照组相比,LPS-PG组细胞中IL-1β和HMGB1的水平、NLRP3、cleaved-caspase-1和TXNIP蛋白表达均显著增加,且NLRP3和ASC、NLRP3和cleaved-caspase-1、TXNIP和NLRP3的蛋白互作能力显著增强(P＜0.05),而两组ASC蛋白的表达无显著差异(P＞0.05).结论:LPS-PG可抑制mPDLFs细胞的增殖和迁移,其机制与Nlrp3炎性体的形成与活化有密切的关系.