以己二酸单甲酯(2)作为起始原料,经酰氯化、Nenitzescu反应得6-氧代-8-氯辛酸甲酯(4),4经取代、缩合得(E)-8-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-6-(2-甲苯磺酰肼亚基)辛酸甲酯(6),6经过还原、肼解及水解反应,得8-氨基辛酸(1),该化合物是合成渗透增强剂N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)的重要起始物.1的新合成路线总收率为58.9％(以2计),纯度99.83％.该工艺条件温和,原料经济易得,操作简单,具有良好的产业化前景.

目的:利用非靶向代谢组学方法,分析口源性口臭患者和健康人舌苔代谢物差异,寻找口源性口臭差异显著代谢物作为生物标志物.方法:采用液相色谱质谱技术结合主成分分析法和正交偏最小二乘法-判别分析法,分别对12例口源性口臭患者和12名健康人舌苔样本进行非靶向代谢组学研究,以正交偏最小二乘法-判别分析法模型中变量投影重要性值＞1和t检验P＜0.05为标准筛选并确定差异性代谢物.结果:口源性口臭患者和健康人舌苔代谢物存在差异,鉴定到11个差异代谢物,谷氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸、色氨酰-脯氨酸、脱氧腺苷、4,5-二氢白色向日葵素、N-乙酰-DL-色氨酸、帕拉米松乙酸酯、环戊醇、(2-己基环戊亚基)肼硫代甲酰胺、L-哌可酸和牛磺酸.其中口源性口臭组中的甘氨酸-苯丙氨酸和N-乙酰-DL-色氨酸表达显著上调,而牛磺酸表达显著下调.结论:口源性口臭患者和健康人的舌苔代谢物存在差异,具有诊断价值的差异代谢物或可作为口源性口臭的诊断标志物.

目的 制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性.方法 在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间.通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性.以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino) pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质.通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性.将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性.结果 多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×105 g/mol降为1.175×105 g/mol.核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变.结合物的游离多糖质量分数为4.55％,游离载体蛋白质质量分数为1.08％.抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合.PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1～3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001).结论 制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答.

目的 制备载酞菁锌透明质酸纳米凝胶,并考察其产生自由基的能力.方法 以透明质酸为亲水大分子、胆固醇为疏水小分子、己二酸二酰肼为连接基团,制备两亲性透明质酸衍生物.以所制透明质酸衍生物为载体材料,制备载光敏剂酞菁锌的纳米凝胶,并测定其包封率、载药量及产生自由基的能力.结果 成功合成了透明质酸衍生物,并制得粒径约205 nm的载酞菁锌透明质酸纳米凝胶.所制载药纳米凝胶的包封率为81.78％,载药量为3.22％.载酞菁锌纳米凝胶经激光照射后自由基的产量明显高于未经激光照射的载药纳米凝胶.结论 制备的两亲性透明质酸衍生物可通过物理自组装形成纳米凝胶,红外激光照射可促进负载酞菁锌的纳米凝胶产生自由基,具有用于光动力治疗的潜力.

目的 研究基于透明质酸(HA)-己二酸二酰肼(ADH)/RGD寡肽功能化果胶(PAD)的可注射HA-ADH/PAD-RGD水凝胶体系的软骨形成作用.方法 采用腙交联法合成水凝胶.通过分析HA-ADH与PAD-RGD不同质量比(8:2、6:4、4:6)HA-ADH/PAD-RGD水凝胶的形态学、凝胶时间、力学强度、降解时间、细胞增殖和软骨作用等因素,综合评价该水凝胶的特性.结果 质量比从8:2减小到6:4和4:6时,水凝胶时间从(132.8±4.8)s分别增加到(188.7±10.1)s和(328.9±12.6)s(P<0.01),平衡溶胀比(ESR)从32.8±1.5分别依次增大到34.8±2.3和36.4±1.9(P<0.01).经过49 d降解后,8:2、6:4、4:6质量比组水凝胶的剩余质量比依次为85.3％、73.5％和55.9％.另外,随着质量比减小,水凝胶的力学强度不断减小.培养1 d后8:2、6:4、4:6质量比组水凝胶的dsDNA含量分别为(0.7±0.1)μg、(0.6±0.1)μg、(0.6±0.1)μg(P>0.05).培养21 d后,6:4组水凝胶dsDNA含量为(1.9±0.2)μg明显高于8:2组[(1.6±0.1)μg,P<0.05]和4:6组[(1.5±0.1)μg,P<0.05].6:4组水凝胶Ⅱ型胶原基因的表达为2.3±0.2明显高于8:2组(1.3±0.2,P<0.05)和4:6组(1.0±0.1,P<0.05).6:4组糖胺聚糖(GAG)产生量为(16.5±1.4)μg明显高于8:2组[(9.1±1.4)μg,P<0.05]和4:6组[(8.8±1.0)μg,P<0.05].包裹在6:4组水凝胶中软骨细胞胶原Ⅱ型免疫着色的细胞百分比为(83.7±15.7)％,明显高于8:2组[(53.3±9.2)％,P<0.05]和4:6组[(43.9±7.8)％,P<0.05].结论 HA-ADH/PAD-RGD水凝胶具有适宜的凝胶时间,力学强度,良好的组织相容性和细胞相容性,并能增强软骨细胞增殖,维持软骨细胞表型.不同质量比HA-ADH/PAD-RGD水凝胶具有不同性质,6:4质量比水凝胶具有最好的物理化学和生物学性质.

目的 提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物,并分析其理化性质及免疫原性.方法 通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用酶解法纯化LOS,通过1％冰醋酸水解获得寡糖(oligosaccharides,OS),产物经Tricine-SDS-PAGE及核磁共振氢谱(1 H NMR)鉴定.OS的羟基经1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化后,与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)共价结合,制备多糖蛋白结合物,经Sephacryl S-300层析柱纯化后收集结合物原液,并对结合物的理化性质、抗原性进行分析,采用两种剂量(2.5μg/剂和5.0μg/剂)免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性.结果 纯化后LOS纯度>90％,核磁共振结果表明OS结构正确,功能基团得到保留.制备的结合物抗原性未发生改变,经3针免疫后,两种剂量下结合物均有剂次加强效应(P<0.05),且两者差异无统计学意义(P>0.05).结论 将百日咳杆菌OS与TTAH结合是制备百日咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径,并且结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答.

目的 分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM197蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法.方法 采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰肼(ADH)衍生后,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)的催化作用下与CRM197共价结合,获得结合物CPS_CDAPAH-CRM197;将C群多糖不经活化直接通过ADH衍生后,在EDAC的催化下与CRM197共价结合,获得结合物CPS_EDACAH-CRM197.对两种方法制备结合物的多糖含量、游离多糖含量、蛋白含量及多糖衍生度等生化指标进行测定,并计算多糖利用率;将结合物分别于37℃放置2周、3周,20～25℃放置4周和8周后取样,测定游离多糖含量;将两种方法制备的结合物免疫小鼠后,检测小鼠血清中C群多糖IgG抗体水平;体外杀菌试验评价结合物的功能性杀菌抗体水平.结果 结合物CPS_CDAPaH-CRM197的多糖衍生度较低,游离多糖含量较高,平均多糖利用率为12.2％,于37及22～25℃温度下保存稳定性较差;结合物CPS_EDACAH-CRM197的多糖利用率比前者高近2倍,游离多糖含量较低,在37和22 ～ 25℃温度下保存均表现出良好的热稳定性(游离多糖含量均未超过5％).CPS_EDACAH-CRM197组小鼠血清IgG抗体水平显著高于CPS_CDAPAH-CRM197组(P＜0.05),但两者诱导的杀菌抗体水平相当(P＞0.05).结论 C群多糖不经活化直接与蛋白结合的方法更适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备.

目的 探讨影响恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白(25 kDa Plasmodium falciparum sexual stage protein,Pfs25)偶联的因素,优化Pfs25蛋白的偶联反应条件,制备具有免疫原性的Pfs25纯化聚体蛋白.方法 通过对偶联反应时Pfs25蛋白浓度、偶联反应的酸碱度、不同的缓冲液及偶联试剂添加方式的探索,考察不同反应条件对Pfs25蛋白偶联的影响.凝胶过滤层析纯化Pfs25偶联反应产物,双抗体夹心ELISA和SDS-PAGE对凝胶柱洗脱液进行检测,Western blot检测纯化的Pfs25聚体蛋白.结果 Pfs25蛋白偶联反应选择1/15 mol/L Na2 HPO4-KH2 PO4为偶联缓冲液,反应体系在pH 5.6～6.0时偶联效果更好,而Pfs25蛋白反应质量浓度为25 mg/mL时可获得最佳的Pfs25偶联效率(68.67％),凝胶过滤层析法获得Pfs25聚体蛋白,经双抗体夹心ELISA和Western blot检测,形成的Pfs25聚体蛋白保持了与Pfs25蛋白相同的抗体结合能力.结论 优化了Pfs25蛋白最佳偶联反应条件,获得具有免疫原性的Pfs25纯化聚体蛋白.在形成Pfs25聚体中,以二聚体(Pfs25)2为主要形式,兼有少量三聚体(Pfs25)3和四聚体(Pfs25)4.

[目的]研究银杏叶正丁醇部位的化学成分,并对分离得到的化合物进行1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)抗氧化活性评价.[方法]采用聚酰胺、硅胶、反相十八烷基硅烷键合硅胶(octade-cylsilyl,ODS)等色谱柱对银杏叶正丁醇部位进行分离纯化,并根据波谱数据和理化性质对单体化合物进行结构鉴定.采用DPPH和ABTS自由基清除实验对分离得到的化合物进行抗氧化活性评价.[结果]从银杏叶正丁醇部位共分离鉴定了6个化合物,分别为5-羟甲基糠醛(1)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷(3)、邻苯二甲酸二丁酯(4)、姜糖脂A(5)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(6).化合物1、2对DPPH自由基的半数清除率(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为(1 156.49±45.37)μmol· L-1和(529.85±11.36)μmol·L-1,化合物1、2、3对ABTS自由基的IC50分别为(843.06±8.94)μmol·L-1、(87.48±2.28) μmol·L-1和(200.86±11.72)μmol·L-1.[结论]化合物1、4～6为首次从银杏叶中分离得到.化合物1、2在DPPH和ABTS自由基清除实验中均显示出抗氧化活性,化合物3仪表现出清除ABTS自由基的能力.

目的 建立同时定量检测己二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺[N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodimide,EDAC]的液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法,实现多糖蛋白结合物(肺炎球菌结合物、脑膜炎球菌结合物和b型流感嗜血杆菌结合物)中残留ADH和EDAC的定量研究.方法 通过检测EDAC在纯水、中性水溶液[(50 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.8)、200 mmol/L氯化钠水溶液和疫苗培养基)]及0.1％甲酸(formic acid,FA)水溶液中的稳定性,确定实现EDAC完全转换为EDU的前处理条件.优化了色谱柱种类对ADH、EDU和EDAC的保留,以及质谱条件如产物离子、碰撞电压、Q1和Q3电压等对ADH和EDU定量灵敏度的影响,建立以C18WCX(2.1 mm×150 mm,5μm)为固定相,pH2～3的0.1％ FA-水和0.1％FA-乙腈为流动相的LC-MS/MS方法,实现ADH和EDAC(实际检测对象为EDAC的转换产物EDU)的高灵敏度定量分析.对建立方法的精密度、准确度、线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ)进行验证.结果 ADH在水溶液中较稳定,EDAC自溶解开始即水解为EDU,且难以完全转换,导致EDAC测定困难;在样品和标准品溶液中加入FA,可实现EDAC完全且快速的转换为EDU.ADH、EDU和EDAC在C18色谱柱上保留弱,在色谱柱的死时间附近出峰,无法实现这些化合物与样品基质的分离,而本文所选C 18WCX固定相可实现目标化合物的保留且峰形较好.通过前体离子扫描、产物离子扫描,选择目标化合物的前体离子和响应强度较好的产物离子作为MRM的离子对,并用MRM自动优化程序获得目标化合物的最佳Q1、CE和Q3电压值.建立的方法检测的ADH和EDAC含量与峰面积线性关系良好,R2均大于0.999;ADH的LOD为3.96 μg/L、LOQ为15.63 μg/L,EDAC的LOD为0.58 μg/L、LOQ为1.17 μg/L,灵敏度较高;精密度(峰面积RSD＜ 2％)及准确度(回收率为90％～105％)较高.结论 建立的LC-MS/MS方法实现了多糖蛋白结合疫苗中残留ADH和EDAC(通过测定EDU定量EDAC)的高灵敏度检测,与《中国药典》三部(2015版)方法相比,该方法预处理更简单,自动化程度更高且灵敏度更好,适合手多种多糖蛋白结合物中ADH和EDAC残留的检测.