目的·探索先天缺牙相关的外异蛋白A受体(ectodysplasin A receptor,EDAR)基因突变位点,初步分析EDAR基因突变导致综合征型和非综合征型缺牙的原因.方法·研究对象为就诊于上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔第二门诊部的先天缺牙患者及其家系成员,提取其外周血中的基因组DNA进行全外显子组测序.通过初步筛选后,用PolyPhen-2、Mutation Taster、Provean对潜在突变位点的有害性进行预测,对分析后的突变位点进行Sanger测序验证.进行突变位点的保守性分析,使用在线工具Swiss-Model进行同源建模,分析EDAR蛋白的三维结构变化.对患者及其家系成员的先天缺牙和全身发育情况进行临床检查.结果·在纳入的先天缺牙患者中共发现5名EDAR基因突变患者,1名患者携带移码突变c.368_369insC(p.L123fs),4名患者携带错义突变.在EDAR错义突变患者中,有2名患有非综合征型缺牙(non-syndromic tooth agenesis,NSTA),分别携带c.77C＞A(p.A26E)纯合突变和c.380C＞T(p.P127L)杂合突变.另外2名患有少汗型外胚层发育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia,HED),均带有2个基因突变位点:1名为EDAR复合杂合患者,携带来自父亲的EDAR c.77C＞T(p.A26V)和来自母亲的EDAR c.1281G＞C(p.L427F);另1名为EDAR、外异蛋白A(ectodysplasinA,EDA)双基因突变患者,EDAR c.1138A＞C(p.S380R)和EDAc.1013C＞T(p.T338M)均来自母亲,这2个位点在此前的报道中仅与NSTA相关.EDAR c.1281G＞C(p.L427F)、c.77C＞A(p.A26E)为未被报道过的错义突变新位点.错义突变可能通过改变氨基酸残基极性、电荷或体积等,对蛋白空间构象造成影响;移码突变造成了非3整倍数的碱基增加,可能导致蛋白的截短或降解.结论·发现了2个新的EDAR错义突变位点,报道了由EDAR纯合突变导致的NSTA以及由EDA、EDAR双基因突变导致HED的病例,扩展了对于EDAR突变造成HED和NSTA的致病机制的理解.

目的 评估激光治疗过度动态气道塌陷(EDAC)的安全性和有效性.方法 选取2018年1月-2022年8月该院13例经支气管镜证实的EDAC患者,根据是否合并气管支气管软化症(TBM),分为单纯EDAC组(6例)和EDAC + TBM组(7例).所有患者均进行支气管镜下气管支气管激光成形术治疗,比较两组患者治疗前后患者症状、气道塌陷导致气道管腔狭窄情况、氧合指数、改良英国医学研究学会呼吸困难指数(mMRC)和6 min步行试验结果.结果 13例患者共进行了17次气管支气管激光成形术治疗,所用激光功率为8～15 W.其中,4例患者进行了2次气管支气管激光成形术治疗.治疗后,所有患者咳嗽、咳痰、气短和呼吸困难等临床症状均得到改善.单纯EDAC组治疗后1周,气道管腔狭窄程度与治疗前比较,明显好转,差异有统计学意义(P<0.05),治疗后1个月,气道管腔狭窄程度、氧合指数、FEV1%、6 min步行试验和mMRC等指标均较治疗前改善,并在6个月的随访中维持稳定.EDAC+TBM组治疗后1周,气道管腔狭窄程度、氧合指数和mMRC较治疗前明显好转,差异均有统计学意义(P<0.05),部分患者8 d～6个月内再次出现气道管腔狭窄,需要接受球囊扩张、冷冻和支架置入等综合治疗.激光治疗后,部分患者会出现局部坏死和肉芽增生,所有患者均未发现与激光介入操作相关的严重并发症.结论 气管支气管激光成形术治疗EDAC,安全、有效.对于单纯EDAC患者治疗效果好,对于EDAC合并TBM的患者,长期疗效欠佳.

目的 比较白喉无毒突变体(cross-reactive material 197,CRM197)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)结合疫苗在小鼠体内的免疫原性.方法 在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的缩合作用下,将TT和DT用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备TT-AH及DT-AH衍生物,GCMP再分别与TT-AH、DT-AH及CRM197共价结合制备结合物,经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化后,进行化学检测、相对分子质量测定及鉴别试验.用GCMP及3种结合物经皮下注射NIH小鼠,第0、14、28天各免疫1次,分别于首免后第7、21和35天经小鼠颈动脉采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价.结果 GCMP-TT和GCMP-DT的糖/蛋白比及多糖回收率较高,GCMP-CRM197较低,3种结合物游离多糖的含量均在5％以下,相对分子质量分别为5.8× 106、2.8× 106、1.1×106,且均可与GCMP的诊断血清产生沉淀线.3种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,抗体水平均明显高于多糖组(P＜0.05);免疫2针后,GCMP-TT与GCMP-DT组的抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05),而GCMP-TT和GCMP-DT组的抗体水平明显高于GCMP-CRM197组(P＜O.05);免疫3针后,GCMP-TT组小鼠产生抗体水平明显高于GCMP-DT及GCMP-CRM197组(P＜0.05).结论 3种不同载体的GCMP结合物免疫小鼠后均可产生良好的免疫应答,对于共价结合的方法,载体蛋白TT优于其他两种载体.

目的 探讨以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)及白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)为载体的A、C、Y 、W135群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性.方法 将A、C、Y、W135群流脑多糖经溴化氰(CNBr)活化后,以1,6已二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为衍生剂制备相应的衍生物,分别与TT及DT在碳二亚胺[N-(3-Dimethylami-nopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]作用下结合,经Sepharose 4FF凝胶层析纯化后,加入冻干保护剂进行冻干,制备成A、C 、Y 、W135群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗.用两种蛋白载体疫苗分别按1及2.5 μg两个剂量(各型多糖的含量为1和2.5 μg)免疫小鼠,经腹部皮下注射,于0及14d各免疫1次,于首次免疫后第28天经静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清各型抗体水平.结果 1及2.5 μg两个剂量组的阳转率均高于80％,2.5μg免疫组的阳转率优于1μg免疫组;总体上来说,以TT为蛋白载体结合疫苗的阳转率高于以DT为载体的结合疫苗,对A和W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗较明显.结论 以TT及DT为载体制备的A、C、Y、W135群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗均具有良好的免疫原性,TT略优于DT.

目的 了解过度动态气道塌陷(EDAC)在慢阻肺患者中的发病情况,评价EDAC对慢阻肺患者的肺功能、急性加重、运动能力的影响.方法 141例慢阻肺患者进入研究,通过纤支镜检查诊断有无EDAC.合并EDAC的慢阻肺患者为EDAC组,在无合并EDAC的慢阻肺患者中随机选取20例为单纯慢阻肺组.比较两组肺通气功能、弥散功能、六分钟步行距离、近一年急性加重次数.结果 141例慢阻肺患者中合并EDAC者18人,发病率12.77%.两组的肺通气功能、弥散功能、近一年急性加重次数均无统计学显著差异(p均>0.05).EDAC组的分钟通气量、六分钟步行距离显著低于单纯慢阻肺组,差异有统计学显著意义(P<0.05).结论 在部分慢阻肺患者中合并存在过度动态气道塌陷.过度动态气道塌陷对慢阻肺患者肺通气功能无影响,但可使分钟通气量及运动能力下降.

目的 通过对2例具有代表性的动力性良性中央气道狭窄病例的临床特征、影像学、支气管镜检查的复习,提高临床医生对该病的认识.方法 回顾性分析以气管软骨环病变为主的气管支气管软化症(TBM)病例和以气管膜部受损造成的过度动态气道塌陷(EDAC)病例各1例.结果2例患者均以中央气道狭窄、肺功能提示明显的"可逆性气道阻塞"为主要表现;TBM主要特点:胸部多层螺旋CT见气管、支气管壁"剑鞘样改变",气道冠状位直径缩短;气管镜见气管、支气管管腔狭窄、黏膜肿胀、软骨环消失.胸部EDAC见气管、支气管壁呼气相气道横截面积明显减少,气道矢状位直径明显缩短.气管镜见软骨环清晰,呼气时膜部向管腔内突出,气道呈新月形改变.结论 动力性良性中央气道狭窄是临床少见疾病.CT检查是有效的筛查手段,最终的诊断需要支气管镜直视下观察诊断.

目的 分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM197蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法.方法 采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰肼(ADH)衍生后,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)的催化作用下与CRM197共价结合,获得结合物CPS_CDAPAH-CRM197;将C群多糖不经活化直接通过ADH衍生后,在EDAC的催化下与CRM197共价结合,获得结合物CPS_EDACAH-CRM197.对两种方法制备结合物的多糖含量、游离多糖含量、蛋白含量及多糖衍生度等生化指标进行测定,并计算多糖利用率;将结合物分别于37℃放置2周、3周,20～25℃放置4周和8周后取样,测定游离多糖含量;将两种方法制备的结合物免疫小鼠后,检测小鼠血清中C群多糖IgG抗体水平;体外杀菌试验评价结合物的功能性杀菌抗体水平.结果 结合物CPS_CDAPaH-CRM197的多糖衍生度较低,游离多糖含量较高,平均多糖利用率为12.2％,于37及22～25℃温度下保存稳定性较差;结合物CPS_EDACAH-CRM197的多糖利用率比前者高近2倍,游离多糖含量较低,在37和22 ～ 25℃温度下保存均表现出良好的热稳定性(游离多糖含量均未超过5％).CPS_EDACAH-CRM197组小鼠血清IgG抗体水平显著高于CPS_CDAPAH-CRM197组(P＜0.05),但两者诱导的杀菌抗体水平相当(P＞0.05).结论 C群多糖不经活化直接与蛋白结合的方法更适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备.

目的 制备甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphiA,SPA)O特异多糖(O-specific polysaccharide,OSP)-霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit,CTB)结合疫苗,并初步探讨其理化及生物学特性.方法 SPA OSP多糖原液(简称OSP多糖)经溴化氰活化,己二酰肼(ADH)衍化,在碳二亚胺(EDAC)作用下与CTB偶联,结合物经Sepharose4FF柱纯化,获得多糖-蛋白结合物,对其理化指标、血清特异性、免疫原性及血清体外杀菌力进行检测.结果 制备的SPA OSP-CTB结合物(简称OSP-CTB结合物)衍化度为(2.63±0.13)％、多糖回收率为(74±0.2)％;鉴别试验显示OSP-CTB结合物与SPA O诊断血清、CTB抗体均有阳性沉淀线产生;免疫小鼠血清中OSP-CTB结合物抗体滴度显著增长,阳转率达100％,血清体外杀菌抗体滴度为1∶64.结论 用溴化氰活化多糖制备的SPA OSP-CTB结合物具有良好免疫原性,可进一步进行疫苗研发.

目的 建立同时定量检测己二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺[N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodimide,EDAC]的液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法,实现多糖蛋白结合物(肺炎球菌结合物、脑膜炎球菌结合物和b型流感嗜血杆菌结合物)中残留ADH和EDAC的定量研究.方法 通过检测EDAC在纯水、中性水溶液[(50 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.8)、200 mmol/L氯化钠水溶液和疫苗培养基)]及0.1％甲酸(formic acid,FA)水溶液中的稳定性,确定实现EDAC完全转换为EDU的前处理条件.优化了色谱柱种类对ADH、EDU和EDAC的保留,以及质谱条件如产物离子、碰撞电压、Q1和Q3电压等对ADH和EDU定量灵敏度的影响,建立以C18WCX(2.1 mm×150 mm,5μm)为固定相,pH2～3的0.1％ FA-水和0.1％FA-乙腈为流动相的LC-MS/MS方法,实现ADH和EDAC(实际检测对象为EDAC的转换产物EDU)的高灵敏度定量分析.对建立方法的精密度、准确度、线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ)进行验证.结果 ADH在水溶液中较稳定,EDAC自溶解开始即水解为EDU,且难以完全转换,导致EDAC测定困难;在样品和标准品溶液中加入FA,可实现EDAC完全且快速的转换为EDU.ADH、EDU和EDAC在C18色谱柱上保留弱,在色谱柱的死时间附近出峰,无法实现这些化合物与样品基质的分离,而本文所选C 18WCX固定相可实现目标化合物的保留且峰形较好.通过前体离子扫描、产物离子扫描,选择目标化合物的前体离子和响应强度较好的产物离子作为MRM的离子对,并用MRM自动优化程序获得目标化合物的最佳Q1、CE和Q3电压值.建立的方法检测的ADH和EDAC含量与峰面积线性关系良好,R2均大于0.999;ADH的LOD为3.96 μg/L、LOQ为15.63 μg/L,EDAC的LOD为0.58 μg/L、LOQ为1.17 μg/L,灵敏度较高;精密度(峰面积RSD＜ 2％)及准确度(回收率为90％～105％)较高.结论 建立的LC-MS/MS方法实现了多糖蛋白结合疫苗中残留ADH和EDAC(通过测定EDU定量EDAC)的高灵敏度检测,与《中国药典》三部(2015版)方法相比,该方法预处理更简单,自动化程度更高且灵敏度更好,适合手多种多糖蛋白结合物中ADH和EDAC残留的检测.

Objective:This study aimed to describe,optimize and evaluate a method for preparing multivalent conjugate vaccines by simultaneous conjugation of two different bacterial capsular polysaccharides(CPs)with tetanus toxoid(TT)as bivalent conjugates.Methods:Different molecular weights(MWs)of polysaccharides,activating agents and capsular polysaccharide/protein(CP/Pro)ratio that may influence conjugation and immunogenicity were investigated and optimized to prepare the bivalent conjugate bulk.Using the described method and optimized parameters,a 20-valent pneumococcal conjugate vaccine and a bivalent meningococcal vaccine were developed and their effectiveness was compared to that of corresponding licensed vaccines in rabbit or mouse models.Results:The immunogenicity test revealed that polysaccharides with lower MWs were better for Pn1-TT-Pn3 and MenA-TT-MenC,while higher MWs were superior for Pn4-TT-Pn14,Pn6A-TT-Pn6B,Pn7F-TT-Pn23F and Pn8-TT-Pn11A.For activating polysaccharides,1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP)was superior to cyanogen bromide(CNBr),but for Pn1,Pn3 and MenC,N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDAC)was the most suitable option.For Pn6A-TT-Pn6B and Pn8-TT-Pn11A,rabbits immunized with bivalent conjugates with lower CP/Pro ratios showed significantly stronger CP-specific antibody responses,while for Pn4-TT-Pn14,higher CP/Pro ratio was better.Instead of interfering with the respective immunological activity,our bivalent conjugates usually induced higher IgG titers than their monovalent counterparts.Conclusion:The result indicated that the described conjugation technique was feasible and efficacious to prepare glycoconjugate vaccines,laying a solid foundation for developing extended-valent multivalent or combined conjugate vaccines without potentially decreased immune function.