目的:探索长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01133对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）成牙骨质分化潜能的影响及其作用机制。方法:收集2021年9月至2022年1月第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科17~30岁10例就诊患者因正畸需要或因阻生拔除的牙齿共12颗，从离体牙上提取hPDLSC，分别转染靶向LINC01133小干扰RNA（small interfering RNA-LINC01133，si-LINC01133）或阴性对照小干扰RNA（small interfering RNA-negative control，si-NC），以转染si-LINC01133为实验组，转染si-NC为阴性对照组。利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测si-LINC01133的沉默效率；通过蛋白质印迹法检测hPDLSC成牙骨质分化相关蛋白包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP）、牙骨质蛋白1（cementum protein-1，CEMP-1）的表达；利用流式细胞术和线粒体超氧化物指示剂MitoSOX检测细胞线粒体活性氧产量；通过JC-1荧光染色法检测线粒体膜电位水平；利用蛋白质印迹法检测线粒体呼吸链复合体蛋白包括NADH脱氢酶［泛醌］1β亚单位8（NADH dehydrogenase［ubiquinone］1 beta subcomplex subunit 8，NDUFB8）、琥珀酸脱氢酶亚单位A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，SDHA）、泛醌-细胞色素c还原酶核心蛋白1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1，UQCR1）、细胞色素c氧化酶亚单位4亚型1（cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1，COXⅣ）、ATP合成酶F1亚单位α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A）的表达水平。结果:hPDLSC的LINC01133表达水平被si-LINC01133有效沉默（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.385±0.128）（ t=10.72， P<0.01），沉默效率超过60%。LINC01133沉默后，hPDLSC BSP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.664±0.179）（ t=4.62， P<0.01）；CAP表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.736±0.229）（ t=2.83， P<0.05）。LINC01133沉默后，hPDLSC线粒体活性氧产量显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.458±0.185） （t=4.96， P<0.05）；线粒体膜电位水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.209±0.029）（ t=53.99， P<0.01）；NDUFB8表达水平显著上升（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：1.683±0.397）（ t=3.45， P<0.05）；SDHA表达水平显著下降（阴性对照组：1.000±0.000，实验组：0.428±0.228）（ t=5.02， P<0.05）。实验组UQCR1、COXⅣ和ATP5A的表达水平与阴性对照组相比差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:LINC01133可能通过调控hPDLSC线粒体功能，进而影响hPDLSC成牙骨质分化潜能。

目的:构建Stat3-shRNA慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的信号传导及转录激活因子3(Stat3)沉默对小鼠成牙骨质细胞OCCM-30分化、凋亡、自噬的影响及相关机制.方法:构建含有Stat3 shRNA的慢病毒载体,包装慢病毒后感染OCCM-30细胞,使用嘌呤霉素筛选出稳定细胞株.采用real-time PCR和Western Blot法检测慢病毒对Stat3的抑制效果.将细胞分成空白对照组、阴性对照组和Stat3抑制组三组,采用Western Blot检测Atg-5,Beclin-1,cleaved caspase-3,survivin蛋白水平的变化,使用real-time PCR法检测BSP,OCN,osterix在mRNA水平的变化.结果:成功构建Stat3-shRNA慢病毒表达载体并用慢病毒感染OCCM-30细胞,有效降低了Stat3的mRNA和蛋白的表达量.在mRNA水平上,Stat3抑制组BSP,OCN,osterix表达量降低.由Western Blot结果可知,Stat3抑制组Atg-5,Beclin-1,survivin蛋白表达量明显降低,cleaved caspase-3蛋白表达量增加.结论:慢病毒介导的Stat3-shRNA可有效抑制OCCM-30细胞内Stat3基因表达,从而抑制细胞分化和自噬,诱导凋亡,其相关机制可能是通过抑制Stat3信号转导通路实现的.

目的:探讨Wnt家族5A蛋白(Wnt5a)在小鼠出生后牙骨质中的表达特点以及其对体外培养成牙骨质细胞分化的影响,阐明Wnt非经典通路调控牙根发育的机制.方法:选择出生后0.5、4.5、10.5、16.5、20.5、24.5、26.5和30.5 d昆明小鼠并按以上相应时间点分组,每组3只;在相应时间点采用脱臼法处死小鼠,分离下颌第一磨牙及牙周组织.免疫组织化学染色法观察小鼠牙体和牙周组织中Wnt5a的表达特点.将小鼠成牙骨质细胞OCCM30分为实验组和对照组.实验组加入200 μg·L-1重组Wnt5a蛋白,对照组无添加;提取细胞总RNA.RT-PCR法检测2组OCCM30细胞中Ocn、Opn、Al p、Bsp、Wnt5a和Runx-2基因的相对表达水平.结果:小鼠出生后0.5d,第一磨牙牙胚中无Wnt5a阳性表达;出生后4.5d,成釉细胞和成牙本质细胞中Wnt5a阳性表达较强;出生后16.5d,可见成牙骨质细胞中Wnt5a呈阳性表达;出生后20.5～30.5 d,成牙本质细胞和牙周膜细胞中Wnt5a呈阳性表达.与对照组比较,实验组成牙骨质细胞中Ocn和Alp基因相对表达水平降低(P＜0.05).结论:Wnt5a在牙根发育过程中的表达特点为从无到有,呈现规律性表达;Wnt5a下调分化基因的表达,在牙骨质发育中发挥重要作用.

目的:探讨内皮素B受体(ETBR)激动剂对成牙骨质细胞系OCCM-30生物学行为的影响,为牙源性牙根修复提供实验依据.方法:选取对数生长期的小鼠成牙骨质细胞,分为实验组和对照组.实验组采用10-6 mol·L-1 ETBR激动剂处理成牙骨质细胞,以未处理的细胞为对照组.采用MTT方法检测培养不同时间点(24、48和72 h)2组成牙骨质细胞增殖抑制率,流式细胞术检测培养不同时间点(24、48和72 h)2组细胞凋亡率,碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测细胞体外分化及矿化情况,实时定量PCR检测各组细胞中Runx2、BSP、OCN、Col1和Osterix等分化相关基因表达水平.结果:MTT检测,与对照组比较,培养24、48和72 h后,实验组细胞增殖抑制率明显升高(P＜0.05),培养48h时细胞增殖抑制率最高.流式细胞术检测,与对照组比较,实验组成牙骨质细胞凋亡率无明显变化.碱性磷酸酶和茜素红染色检测,与对照组比较,实验组细胞显色较浅,产生矿化结节较少.实时定量PCR检测,与对照组比较,在培养24 h时实验组细胞中Runx2、BSP、Osterix、OCN和Col1表达水平无明显变化,在培养48 h时上述基因表达水平开始降低,在培养72 h时细胞中Runx2、BSP、Osterix和Col1表达水平明显降低(P＜0.01).结论:ETBR激动剂可抑制成牙骨质细胞增殖和分化,但对细胞凋亡无影响.

目的:通过过表达或抑制microRNA-675-5p (miR-675-5p), 观察miR-675-5p对小鼠成牙骨质细胞OCCM-30分化的影响.方法:用矿化诱导培养基诱导OCCM-30细胞分化, 检测各矿化指标及miR-675-5p的含量变化.而后利用Lipofectamine 3000脂质体分别将miR-675-5p的mimic和inhibitor及对应的negative control转染进OCCM-30细胞, 采用real-time PCR技术验证转染是否成功, 继而采用real-time PCR和Western Blot的方法检测矿化相关指标ALP, OSX, RUNX2, BSP的含量变化, 利用ALP活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性变化.结果:Real-time PCR结果显示在OCCM-30细胞分化过程中miR-675-5p表达下调, 在mimic组miR-675-5p表达上调明显, 同时ALP, OSX, RUNX2表达下降, Western Blot证明OSX, RUNX2与BSP在蛋白水平上表达同样明显降低, ALP活性试剂盒检测提示ALP活性被抑制.Inhibitor组结果与mimic组恰好相反.结论:miR-675-5p抑制OCCM-30细胞的分化能力.

目的:探讨熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞分化的影响,为牙根吸收的修复提供理论依据.方法:将对数生长期的OCCM-30细胞分为对照组和不同浓度熊果酸组.其中熊果酸组OCCM-30细胞以3种浓度(0.625、1.250和2.500μmol·L-1)的熊果酸处理,对照组不做任何处理.采用MTT法检测不同时间点(24、48和72 h)各组OCCM-30细胞增殖抑制率,碱性磷酸酶(ALP)法检测细胞体外分化和矿化情况,实时定量PCR法检测24 h内骨桥蛋白(OPN)mRNA表达水平,Western blotting法检测给药3和5 d时OPN蛋白表达水平.结果:不同浓度熊果酸组与对照组OCCM-30细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05).与对照组比较,2.500μmol·L-1熊果酸组熊果酸处理3、5和7 d后,OCCM-30细胞中ALP活性明显升高(P<0.05),不同浓度熊果酸组OCCM-30细胞中OPN mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01).结论:一定浓度熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞增殖无明显抑制作用,但可促进其分化并上调OPN mRNA和蛋白表达水平.

水凝胶作为一种新兴的功能高分子材料,具有较大的开发潜力,在生物工程中有着广泛的应用.且因其有着良好的生物相容性,在医学领域也逐渐受到重视.有研究表明水凝胶缓释系统与生长因子结合后能够很好地促进人牙周膜成纤维细胞的增殖与黏附,并有效地促进其向成骨细胞及成牙骨质细胞分化.该文就水凝胶于牙周组织再生中的应用作一简要综述.

目的 探讨牙周膜干细胞(PDLSC)成牙骨质向分化过程中mir-30a-wnt/β-catenin信号轴调控组织蛋白酶K(CTSK)表达的功能作用.方法 极限稀释法分离培养PDLSC,釉基质蛋白衍生物(EMD)诱导细胞成牙骨质向分化.在细胞分化过程中,通过microRNA芯片筛选差异表达的microRNA.首先,给予不同分组细胞EMD诱导和/或抑制microRNA表达等处理,无干预组细胞作为对照.利用qPCR和Western blot技术首先验证差异表达的microRNA是否能够调控CTSK的表达.之后,将细胞膜片复合陶瓷支架材料植入裸鼠皮下,利用免疫组织化学方法观察成牙骨质细胞标记蛋白CAP和CEMP-1的表达变化,明确受microRNA调控的CTSK表达变化是否参与了PDLSC成牙骨质分化.在此基础上,从蛋白学水平观察wnt信号通路在microRNA调节CTSK表达过程中是否发挥了相应功效.结果 EMD诱导PDLSC成牙骨质向分化过程中,多种microRNA表达发生变化,其中miR-30a表达出现特异性上调(P<0.05).表达上调的miR-30a进一步调节CTSK的表达(P<0.05),促进PDLSC异位形成类牙骨质样结构,高表达成牙骨质细胞标记蛋白CAP和CEMP-1.抑制wnt/β-catenin信号通路,miR-30a对CTSK的表达调控作用出现相应减弱.结论 EMD可能通过上调miR-30a的表达激活wnt/β-catenin信号通路从而经mir-30a-wnt/β-catenin信号轴调控CTSK诱导PDLSC向成牙骨质细胞方向分化.

牙骨质是包绕在牙根表面的骨样矿化结构,是牙周组织的重要组成部分,具有维持牙齿稳定、补偿与修复、保护牙本质等功能,牙骨质的形成和再附着是牙周组织再生的成功标志.成牙骨质细胞(CM)是牙骨质形成的功能细胞,成牙骨质细胞的分化调控机制对于认识牙骨质形成和牙周功能维护具有重要意义.本文对影响成牙骨质细胞分化的信号通路及调控分子进行综述.