目的 探索三氯异氰尿酸(TCCA)对小鼠睾丸精原细胞GC-1氧化应激和DNA甲基化的影响.方法 以TCCA 0(细胞对照),97,194和387 μmol·L-1处理GC-1细胞24 h;CCK-8法检测细胞存活率;Hoechst 33342染色检测各组细胞形态和凋亡率;流式法检测细胞周期;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞凋亡相关基因Bax和Fas、氧化应激相关基因线粒体超氧化物歧化酶(SOD2)、铁死亡相关基因谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)、核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)、DNA甲基化转移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基转移酶3L(DNMT3L)mRNA表达水平;Griess法测定GC-1细胞一氧化氮(NO)含量,比色法测定丙二醛(MDA)水平;DCFH-DA荧光探针法测定GC-1细胞活性氧(ROS)水平,DNTB比色法测定还原型谷胱甘肽(GSH)含量,WST-8法测定还原型辅酶Ⅱ(NADPH)含量.结果 与细胞对照组相比,TCCA 194和387 μmol·L-1组细胞存活率降低(P<0.01),出现细胞核固缩及核碎裂,细胞凋亡率显著增加(P<0.01),细胞被阻滞在G2/M期(P<0.05);TCCA 387 μmol·L-1组细胞NO和MDA含量增加(P<0.01),ROS水平升高(P<0.01),GSH和NADPH含量降低(P<0.01),SOD2,GPX4,Nrf2,SLC7A11和DHODH mRNA表达减少(P<0.05,P<0.01);Bax,Fas,DNMT3L和DNMT3A mRNA表达增加(P<0.05,P<0.01).结论 TCCA可降低GC-1细胞存活率,抑制细胞增殖,引起细胞凋亡.其机制可能与其破坏抗氧化系统、增强氧化应激、诱导铁死亡及干扰GC-1细胞甲基化有关.

目的:观察热补针法对类风湿关节炎(RA)寒证家兔膝关节滑膜炎性反应及滑膜组织、血清中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、糖酵解活性的影响,探讨热补针法治疗RA的机制.方法:选取32只新西兰兔随机分为正常组、模型组、抑制剂组、热补针法组,每组8只.采用卵蛋白联合弗氏完全佐剂诱导及低温冷冻法复制RA寒证模型.抑制剂组给予2-甲氧基雌二醇腹腔注射,热补针法组给予热补针法针刺"足三里",留针30 min.各组干预均1次/d,连续14 d.观察家兔膝关节周径及痛阈变化;采用ELISA法检测家兔血清中还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、己糖激酶(HK2)、6-磷酸果糖激酶2/2,6-二磷酸果糖激酶3(PFKFB3)含量;HE染色法观察家兔膝关节滑膜组织形态变化;免疫组织化学法检测家兔膝关节滑膜组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-17的阳性表达;分光光度法检测家兔膝关节滑膜组织中乳酸含量;Western blot法检测膝关节滑膜组织中HIF-1α、乳酸脱氢酶(LDHA)、丙酮酸激酶 2(PKM2)蛋白表达水平.结果:干预后,与正常组比较,模型组家兔膝关节周径增大(P<0.05),痛阈值降低(P<0.05),可见滑膜细胞中度增生及炎性浸润,滑膜组织病理评分升高(P<0.05),滑膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17阳性表达及乳酸含量均升高(P<0.05),血清NADPH、HK2、PFKFB3含量及滑膜组织中HIF-1α、LDHA、PKM2蛋白表达水平均升高(P<0.05).与模型组比较,抑制剂组及热补针法组家兔膝关节周径缩小(P<0.05),痛阈值升高(P<0.05),滑膜增生、炎性细胞浸润均改善,滑膜组织病理评分降低(P<0.05),滑膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17阳性表达及乳酸含量均下降(P<0.05),血清NADPH、HK2、PFKFB3含量及滑膜组织中HIF-1α、LDHA、PKM2蛋白表达水平均下降(P<0.05).与抑制剂组比较,热补针法组家兔滑膜组织病理评分升高(P<0.05),滑膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17阳性表达及乳酸含量均升高(P<0.05),血清NADPH、HK2、PFKFB3含量及滑膜组织中HIF-1α、LDHA、PKM2蛋白表达水平均升高(P<0.05).结论:热补针法干预RA寒证家兔可提高痛阈,减小膝关节周径,抑制炎性反应,其作用机制与下调HIF-1α及糖酵解活性相关.

目的:观察朱琏抑制Ⅱ型针法治疗肺癌化疗后胃肠道反应的临床疗效.方法:将90例患者随机分为西药组、普通针刺组和治疗组,每组30例,西药组采用盐酸甲氧氯普胺注射联合盐酸托烷司琼治疗,同时予盐酸洛哌丁胺胶囊口服;普通针刺组在西药组基础上采用普通针刺治疗,针刺选取内关、足三里、中脘和上巨虚穴;治疗组在西药组的基础上,采用朱琏抑制Ⅱ型针法治疗,选穴同普通针刺组.分别于治疗后第1天、3天与5天,比较3组患者胃肠道反应(恶心呕吐、腹泻)改善情况.结果:3组治疗后恶心呕吐症状、腹泻症状显著改善,差异具有统计学意义(P＜0.05);治疗后,治疗组的恶心呕吐、腹泻症状改善程度优于西药组、普通针刺组,差异具有统计学意义(P＜0.05).治疗组治疗总有效率93.33％(28/30),高于西药组的53.33％(16/30)、普通针刺组的73.33％(22/30),差异具有统计学意义(P＜0.05).治疗组白细胞计数降低程度较西药组、普通针刺组少,差异具有统计学意义(P＜0.05),3组红细胞计数、血小板计数比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:运用朱琏抑制Ⅱ型针法可有效缓解肺癌化疗后胃肠道反应,疗效显著.

目的 观察热补针法对类风湿关节炎(RA)寒证模型家兔滑膜组织自噬-NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体-白细胞介素(IL)-1β信号轴的影响,探讨热补针法治疗RA滑膜炎症的作用机制.方法 48只新西兰家兔随机分为正常组、模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、雷帕霉素组、热补针法组及平补平泻组,每组8只.以弗氏完全佐剂+卵蛋白诱导联合低温冷冻法复制RA寒证家兔模型.热补针法组和平补平泻组于"足三里"分别施热补针法及平补平泻针法针刺,留针30 min,1次/d,连续14 d;3-MA组和雷帕霉素组分别耳缘静脉注射3-MA和雷帕霉素溶液,1次/2 d,共7次.免疫组化染色检测膝关节滑膜组织IL-1β表达,免疫荧光染色检测滑膜组织NLRP3表达,透射电镜观察滑膜细胞自噬小体形态,Western blot检测滑膜组织自噬蛋白5(Atg5)、UNC-51样激酶1(ULK1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin-1蛋白表达.结果 与正常组比较,模型组家兔膝关节周径显著增加、皮温显著降低(P<0.05),滑膜组织IL-1β、NLRP3表达显著升高(P<0.05),Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.05).与模型组比较,3-MA组家兔膝关节周径显著增加、皮温显著降低(P<0.05),滑膜组织IL-1β、NLRP3表达显著升高(P<0.05),Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.05);热补针法组、平补平泻组和雷帕霉素组家兔膝关节周径显著缩小、皮温显著升高(P<0.05),滑膜组织IL-1β、NLRP3表达显著降低(P<0.05),Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05),且热补针法组作用优于平补平泻组.透射电镜观察显示,正常组家兔滑膜细胞胞浆内自噬小体、溶酶体散在分布;模型组和3-MA组家兔滑膜细胞偶见自噬小体分布;雷帕霉素组和热补针法组家兔滑膜细胞可见吞噬泡及双层膜结构的自噬小体,溶酶体数量增加;平补平泻组家兔滑膜细胞偶见吞噬泡、自噬小体及溶酶体等结构.结论 热补针法能抑制RA寒证模型家兔膝关节滑膜炎症反应,其机制可能与调节自噬-NLRP3炎症小体-IL-1β信号轴有关.

目的 探讨依达拉奉(Eda)对帕金森病(PD)模型细胞和秀丽隐杆线虫中氧化应激(OS)、自噬水平及α-突触核蛋白(α-syn)表达的影响.方法 取对数生长期大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株 PC12 细胞,用200 μmol/L 6-羟基多巴胺(6-OHDA)制作 PD 模型细胞;将 PC12 细胞分为对照组(不做任何处理)、模型组(6-OHDA处理)及 Eda组(Eda +6-OHDA),分别采用荧光探针法、微量法及可见分光光度法检测各组PC12 细胞中活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用Western blot法和免疫荧光法检测各组细胞α-突触核蛋白(α-syn)、自噬相关蛋白LC3、p62,以及使用自噬抑制剂后α-syn和LC3 的蛋白表达;配制标准生长培养基(NGM)培养秀丽隐杆线虫(BZ555、NL5901 及DA2123),取L3 阶段虫株采用6-OHDA诱导构建PD模型,分为对照组(抗坏血酸处理)、模型组(6-OHDA处理)及 50 μmol/L Eda(低浓度)、200 μmol/L Eda(中浓度)、400 μmol/L Eda(高浓度)组,检测发育至L4 时期的各组BZ555 线虫的身体弯曲数和乙醇偏好指数(PI);取L3～L4 时期的对照组、模型组及中浓度Eda组BZ555 虫株采用荧光显微成像法检测DA能神经元的组织学特征、采用荧光显微成像法检测线虫体内的ROS水平;取L3～L4 时期的对照组、模型组、中浓度Eda组NL5901 虫株,采用Western blot法检测线虫体内α-syn蛋白的表达;取L3～L4 时期对照组、模型组、中浓度Eda组的NL5901 和DA2123 线虫,另设中浓度Eda +3-MA组的NL5901 和DA2123 线虫,采用荧光显微成像法检测各组DA2123 线虫中的自噬小体数量和NL5901 线虫中α-syn蛋白的表达.结果 与模型组相比,Eda组PC12细胞ROS水平、MDA含量降低,α-syn蛋白表达降低(P＜0.05 或 P＜0.001),SOD活力升高、自噬相关蛋白LC3表达升高及p62 表达降低(P＜0.01 或 P＜0.05);Eda +3-MA组相较于Eda组α-syn蛋白表达升高(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达降低(P＜0.05);与模型组比较,低、中、高浓度Eda组BZ555 线虫DA依赖行为表现相对正常,中浓度Eda组BZ555 线虫ROS水平降低(P＜0.01),中浓度Eda组NL5901 线虫α-syn蛋白表达降低(P＜0.05),使用自噬抑制剂后表达升高(P＜0.05);中浓度Eda组DA2123 线虫自噬小体数量增多(P＜0.01),使用自噬抑制剂后数量减少(P＜0.05).结论 Eda能有效降低6-OHDA诱导PD模型PC12 细胞和线虫的OS水平,激活自噬通路,降解α-syn蛋白聚集.

目的 观察朱琏抑制Ⅱ型针法干预盆腔炎性疾病后遗症(SPID)大鼠的效果,并基于前列腺素(PG)F2α、PGE2、血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶2(MMP2)探讨其作用机制.方法 将55 只雌性未孕SD大鼠随机分为空白组、模型组、西药组、普通针刺组(普针组)、朱琏抑制Ⅱ型针法组(针法组).除空白组外,其他组采用宫内注射混合菌液联合机械损伤法制备SPID大鼠模型.造模成功后,给予西药组灌胃阿奇霉素治疗,给予普针组普通针刺治疗,给予针法组朱琏抑制Ⅱ型针法治疗,空白组与模型组不给予任何治疗.连续干预4 周后,处死各组大鼠,观察各组大鼠子宫形态学及组织病理学改变,检测各组大鼠血清PGF2α、PGE2 含量及子宫组织VEGF、MMP2 蛋白表达水平.结果 (1)模型组大部分大鼠子宫肿胀、充血、双侧形态不对称,盆腔组织广泛粘连且有积液;子宫组织可见大量炎症细胞浸润,组织结构紊乱,并出现轻微纤维化.各干预组大鼠子宫形态、子宫组织炎症优于模型组,针法组大鼠的改善更为明显.(2)与空白组相比,模型组及各干预组大鼠血清PGF2α和PGE2 含量、子宫组织VEGF、MMP2 的蛋白表达水平均升高(均 P<0.05),针法组上述指标均低于普针组(均P<0.05),但与西药组的差异无统计学意义(均P>0.05).结论 朱琏抑制Ⅱ型针法可能通过降低血清PGF2α、PGE2 含量,抑制VEGF、MMP2 蛋白表达来发挥治疗SPID的作用,其效果优于普通针刺法,与西药干预效果相近.

目的:比较特定取穴使用朱琏抑制Ⅱ型针法治疗、常规针刺对脑卒中后肢体痉挛患者运动功能的临床疗效差异.方法:将100例患者随机分为朱琏抑制Ⅱ型针法组、常规针刺组, 每组各50例.在特定取穴上朱琏抑制Ⅱ型针法组采用抑制Ⅱ型针法进行治疗;常规针刺组采用常规针刺手法治疗, 取穴同朱琏抑制Ⅱ型针法组, 均每天治疗1次, 1个月为1个疗程, 共治疗3个疗程.康复评定采用改良Ashworth痉挛评定、Brunnstrom评定、平衡性协调试验评定、非平衡性协调试验评定、Berg平衡量表评定 (BBS), 分别于治疗前后对各组患者的患侧肢体进行运动功能评定.结果:治疗后朱琏抑制Ⅱ型针法组的改良Ashworth痉挛评定, 评分低于常规针刺组 (P＜0.05);Brunnstrom评定、平衡性协调试验评定、非平衡性协调试验评定的评分、BBS评分高于常规针刺组 (P＜0.05);朱琏抑制Ⅱ型针法组总有效率为82％ (41/50), 高于常规针刺组20％ (10/50, P＜0.05) .结论:特定取穴使用朱琏抑制Ⅱ型针法组治疗脑卒中后肢体痉挛对患者运动功能的临床疗效较常规针刺治疗更为有效.

目的 探讨高良姜黄素(Cur)增强内皮细胞(ECs)自噬水平及抑制损伤血管内膜增生(IH)的作用机制.方法 体外实验中,将人脐血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs)分为4组:对照组、3-MA组、Cur组、雷帕霉素( Rapa)组;采用吖啶橙( AO)染色和溶酶体荧光探针法( Lyso-Tracker Red)观察细胞酸性区室积累;Western-blot、免疫荧光检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、p62、Akt及mTOR的蛋白水平.活体实验中,用球囊压迫法构建颈动脉内膜损伤大鼠模型;60只健康成年雄性SD大鼠分为假手术组、血管损伤组、3-MA组、Cur组和Rapa组;采用Western blot 法检测各组大鼠颈动脉组织LC3-Ⅱ、p62、Akt及mTOR的蛋白水平,HE染色检测IH厚度及有效的管腔面积.结果 体外实验中,与对照组相比,Cur组和Rapa组HUVECs内酸性区室明显增多,同时LC3-Ⅱ蛋白水平增高,p62、Akt及mTOR蛋白水平降低.活体实验中,与对照组相比,损伤血管中的LC3-Ⅱ蛋白水平上升,而p62、Akt 及mTOR蛋白水平稍下降,Cur组和Rapa组大鼠血管中的LC3-Ⅱ蛋白水平明显升高,而p62、Akt及mTOR蛋白水平显著下降. HE染色显示,颈动脉内膜损伤后3周,损伤节段血管可见明显的IH及血管腔狭窄,而Cur组和Rapa组抑制了IH及减轻血管狭窄.无论在体外实验还是活体实验中,3-MA干预后均呈现一个相反的结果.结论 Cur能增加ECs的自噬水平及抑制血管损伤后的IH.其可能机制是抑制了ECs中的Akt／mTOR信号通路.

目的 评价氢对氧糖剥夺-复氧复糖损伤大鼠海马神经保护作用机制与线粒体自噬的关系.方法 出生24 h的健康SD大鼠,体外分离并原代培养海马神经元,以7×105个∕孔的密度将神经元接种于预先用多聚赖氨酸包被过的6孔板中,采用随机数字表法分为5组(n＝30):对照组(C组)、氧糖剥夺-复氧复糖组(OGD∕R组)、氧糖剥夺-复氧复糖+氢气组(OGD∕R+H2组)、氧糖剥夺-复氧复糖+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(OGD∕R+3-MA组)和氧糖剥夺-复氧复糖+氢气+3-MA组(OGD∕R+H2+3-MA组).C组正常培养箱(75％N2-20％O2-5％CO2)中培养24 h;OGD∕R组、OGD∕R+H2组、OGD∕R+3-MA组和OGD∕R+H2+3-MA组制备神经元氧糖剥夺-复氧复糖损伤模型;OGD∕R+H2组造模后,置于富氢培养箱(60％H2-10％O2-5％CO2-25％N2)中培养24 h;OGD∕R+3-MA组造模后,加入自噬抑制剂3-MA 10 mmol∕L,然后置于正常培养箱中培养24 h;OGD∕R+H2+3-MA组造模后,加入3-MA 10 mmol∕L,然后置于富氢培养箱中培养24 h.采用MTT法测定神经元存活率,DCFH-DA荧光探针法测定ROS活性,JC-10法测定线粒体膜电位(MPP),流式细胞术测定神经元凋亡率,Western blot法测定微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PTEN诱导激酶1(PINK1)和Parkin的表达水平,并计算LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值.结果 与C组比较,OGD∕R组及OGD∕R+H2组神经元存活率和细胞MMP 降低,神经元凋亡率和ROS活性升高,PINK1和Parkin的表达水平和LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值升高(P＜0.05);与OGD∕R组比较,OGD∕R+H2组神经元存活率及MMP升高,神经元凋亡率和细胞ROS活性降低,PINK1和Parkin的表达水平和LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值升高,OGD∕R+3-MA组神经元存活率及MMP降低,神经元凋亡率及细胞ROS活性升高,PINK1和Parkin的表达水平及LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值降低(P＜0.05).与OGD∕R+H2组比较,OGD∕R+3-MA组和OGD∕R+H2+3-MA组神经元存活率及MMP降低,神经元凋亡率及细胞ROS活性升高,PINK1和Parkin的表达水平及LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值降低(P＜0.05).结论 氢对氧糖剥夺-复氧复糖损伤大鼠海马神经保护作用机制与促进线粒体自噬有关.

目的 探讨miR-499 rs3746444多态性与宫颈癌临床特征相关性及对宫颈癌细胞增殖的影响作用与机制.方法 应用病例对照研究方法,选取2012年6月至2018年12月于内蒙古自治区人民医院就诊的宫颈癌病人857例作为实验组,同期873例健康志愿者作为对照组,两组年龄均在23～62岁,采用TaqMan探针法对rs3746444位点的多态性进行基因分型;构建包含pGL3-Sox63'UTR和miR-499的GG或AA的海肾荧光素酶载体(Renilla luciferase vector)于prl-sV40质粒中,并采用lipo2000转染人宫颈上皮永生化细胞H8和人宫颈癌细胞系:腺癌样SiHa、上皮样HeLa和C33A,CCK-8法检测细胞增殖;双荧光素报告基因检测法分析Frefly和Renilla荧光素酶活性;Western blot检测Hela和SiHa细胞Cyclin D1、CyclinE、CDK4、CDK6和Sox6蛋白表达.结果 AG和GG基因型宫颈癌发生风险分别是AA基因型个体的1.09倍和2.41倍,携带G等位基因的个体患宫颈癌的风险是AA基因型个体的1.28倍,GG基因型宫颈癌患者ⅡI期及以上的比例显著高于AA基因型.GG表型肿瘤高度分化比例明显高于AA表型组,rs3746444不同基因型对正常宫颈H8细胞的增殖无显著影响.miR-499 GG+Sox6-3'UTR处理组Hela、C33A和SiHa细胞72 h时OD450显著低于miR-499 AA+Sox6-3'UTR组,且高于Sox6-3'UTR组(P<0.05).miR-499 GG+Sox6-3'UTR处理组Hela和SiHa细胞Cyclin D1、CyclinE、CDK4和CDK6显著高于miR-499 AA+Sox6-3'UTR组,低于Sox6-3'UTR组(P<0.05).与miR-499 AA+Sox6-3'UTR处理组相比,miR-499 GG+Sox6-3'UTR处理组Sox6的表达水平增加(P<0.05),且均低于Sox6-3'UTR对照组(P<0.05).结论 miR-499的rs3746444突变(A>G)与宫颈癌肿瘤生长和分化程度密切相关,其通过上调Sox6介导的CyclinD1高表达具有明显的促进宫颈癌细胞生长增殖作用.