为探究小黄花茶内生真菌种类和种群分布规律以及对植物病原真菌的抑制作用,该研究采用组织分离法对小黄花茶内生真菌进行分离纯化,基于形态学和分子生物学进行鉴定并结合统计学分析评价其多样性,再通过平板对峙法筛选出具有抑菌活性的菌株.结果表明:(1)从小黄花茶 324 份组织块中分离得到内生真菌 261 株,隶属 1 门 5 纲 9 目 22 属,其中优势属包括炭疽菌属(Colletotrichum)、间座壳属(Diaporthe)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis),分离频率分别为 21.84%、16.86%、10.34%.(2)研究发现小黄花茶内生真菌在不同季节分布不同,冬季分离出的菌株数量最多,为72 株(占27.59%,隶属16 个属),春季62株(隶属 13 个属),夏季 59 株(隶属 15 个属),秋季 68 株(隶属 13 个属),冬季的香农-维纳指数(H′)、辛普森指数(D)、Pielou's均匀度指数(E)和Margalef's丰富度指数(M)最高,春季与冬季内生真菌种类相似性较高,夏季与秋季内生真菌种类相似性较高.(3)小黄花茶内生真菌不同部位分布不同,茎中内生真菌的分布最多,有 102 株(占39.08%,隶属15 个属),根61 株(隶属10 个属),叶98 株(隶属15 个属);茎的H′、D、E、M最高,叶部与茎部内生真菌种类最为相似.(4)平板对峙结果显示,在 35 株供试内生真菌中,有 26 株内生真菌至少对 1 种植物病原真菌有抑制作用,占 74.29%,其中CJ-Ⅱ-2、XY-V-3、QY-Ⅱ-4、QJ-Ⅲ-2、DJ-I-2 对 8种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用,XY-V-3 对 8 种植物病原真菌的抑制效果最佳,抑菌率均高于50%,XY-V-3 和QJ-Ⅲ-2 对 2 株小黄花茶病原真菌的抑菌率高于 50%,具备防治小黄花茶自身病害的潜力.综上所述,小黄花茶内生真菌多样性丰富,部分菌株表现出较好的抑制植物病原真菌的作用,为生物防治产品的研发和小黄花茶病害的防治奠定了基础.

以黄独微型块茎为材料,进行了4℃低温离体保存,并对其进行了转录组分析.结果表明:原始数据进行质量预处理后,对照组(Con25)和处理组(Con4)的reads有效比分别为98.67％和98.69％;对拼接序列去重复后最终得到了219 792个长度大于200bp的transcripts(177 Mb)和161066个Unigenes (99 Mb);Unigenes的NR注释数目最多的10个物种分别为出芽短梗霉EXF-150、葡萄、可可、水稻粳稻组、无油樟、谷子、出芽短梗霉变种nami-biae CBS 147.97、麻疯树、短至生黑醋杆菌CBS 110374和无花果拟盘多毛孢w106-1;样本注释基因最多的5个KOG是一般的功能预测、信号转导机制、翻译后修饰和蛋白质周转以及伴侣、翻译和核糖体结构和生物合成、能源生产和转换;样本KEGG注释Unigenes最多的5个pathway分别为碳代谢、氨基酸生物合成、糖酵解途径、淀粉蔗糖代谢和丙酮酸代谢.注释到的Unigenes个数为26006,注释到的不同酶数为1 177,映射到的不同pathway数为327;样本基因的功能在Biological Process分类中主要聚集于cellular process和metabiolic process,在Cellular Component分类中主要聚集于cell和cell part,在Molecular Function分类中主要聚集于binding和catalytic activity;在黄独微型块茎低温离体保存中,共获得164 145个差异表达基因,其中有63 305个基因表达上调,有100 840个基因表达下调;差异表达基因部分极其显著的GO term有液泡继承、单链断裂修复、纺锤体伸长、麦芽糖分解代谢过程、甘露糖基转移酶的活性、甘露糖磷酸转移酶活性、细胞壁甘露糖蛋白的生物合成过程、G1期细胞有丝分裂周期早期细胞芽和有丝分裂纺锤体定位的建立;差异表达基因部分极其显著的pathway有原发性胆汁酸的生物合成、类固醇激素的合成、氯代环己烷和氯苯降解、双酚A降解、氟苯甲酸降解、糖胺聚糖合成硫酸软骨素、糖胺聚糖合成硫酸乙酰肝素、甲苯降解、萘的降解和核黄素代谢.本实验结果可为黄独微型块茎的种质保存和后续萌发提供理论依据.

目的:对直缘乌头内生真菌Alternaria solani的化学成分进行研究.方法:采用各种柱色谱对直缘乌头内生真菌Al-ternaria solani的甲醇提取物进行分离纯化,经波谱数据(1 H-NMR,13 C-NMR,MS)进行结构鉴定.结果:分离得到15个化合物,分别鉴定为:20-羟基麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(1)、(22E,24R)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(2)、(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β-醇(3)、24-亚甲基-麦角甾-7-烯-3β-醇(4)、过氧麦角甾醇(5)、cyclo(D)-Pro-(D)-Leu(6)、cyclo-(L-Val-L-Pro)(7)、cyclo-(S-Pro-S-Ile)(8)、tentoxin(9)、porrotoxin(10)、7d-ehydroxyl-zinniol(11)、zinniol(12)、8-zinniol methyl ether(13)、3-甲氧基-4-甲基-5-(3',3′-二甲基烯丙氧基)-2甲-氧基甲基苯甲酸(14)、 拟盘多毛孢H2-倍半萜内酯(15).结论:从直缘乌头内生真菌Al etr nra ia soal ni中分离得到15个化合物,其中化合物2～10,12～15是首次从该植物内生真菌中分离得到.

通过液—液萃取、硅胶和凝胶柱层析法,从佛甲草(Sedum lineare)分离出一种可以抑制水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)生长的单体化合物,经质谱分析,确定该化合物为没食子酸(gallic acid,GA).在30 mg·mL?1浓度下,GA能抑制一些植物病原细菌如桃细菌性穿孔病菌(X. campestris pv. pruni)、水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)、水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae)、柑橘溃疡病菌(X. axonopodis pv. citri)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、番茄细菌性斑点病菌(P. syringae pv. tomato)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora)的生长;GA还对11种植物病原真菌如烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、指状青霉(Penicillium digitatum)、滇刺枣褐腐病菌(Streptobotrys strepto?thrix)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、芒果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis mangiferae)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、(Fusarium oxysporum f. sp. niverum)、西瓜专化型尖孢镰刀菌(F. oxysporum f. sp. nicotianae)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的生长具有一定的抑制作用.在300 mg·mL?1浓度下,GA对水稻细菌性条斑病的田间防治效果达到64.62%.该研究结果表明没食子酸具有开发成为一种防治水稻细菌性条斑病的杀菌剂的潜力.

拟盘多毛孢属Pestalotiopsis真菌由于能够产生大量结构新颖活性显著的次生代谢产物,特别是从中发现抗肿瘤药物紫杉醇,成为近年来研究的热点.本研究通过对1株地衣内生真菌Pestalotiopsis sp.的固体培养基次生代谢产物的UPLC-Q-TOF-MS分析,发现该菌株能够产生分子量比较特殊的两个色谱峰.通过进一步的菌株大量发酵,结合硅胶柱色谱,高效液相色谱等技术跟踪分离,得到了2个单体化合物.采用核磁共振波谱技术、质谱技术等方法确定这2个单体化合物平面结构,分别为已知torrenyanic acid衍生物(1)和新化合物pestalotiopsin (2).比对化合物的CD谱及考虑生源关系,确定了新化合物(2)的绝对构型.化合物1和2的体外抑制人白血病细胞K562实验显示二者均具有抗肿瘤活性,IC50值分别为25.2和32.1μmol/L.

常压柱层析(Column chromatography)是天然产物分离的重要手段,可以将复杂多样的天然产物进行纯化.掌握规范的实验方法和操作对化合物的纯化和分离有很多的帮助.以小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)的代谢产物分离为例,说明硅胶柱层析法进行产物分离的实验要点,并对硅胶柱层析过程中常见的问题进行分析,给出相应的处理方法.

蒜头果是我国特有的单种属稀有树种,为了进一步开发利用蒜头果树皮内生真菌的抗菌活性化合物,该研究对来自蒜头果的植物内生真菌(白黄笋顶孢霉、哈茨木霉、大棘黑团孢、枝状枝孢菌、斑污拟盘多毛孢、赭绿青霉、淡紫紫孢菌、朱黄青霉、Xenoacremonium recifei、Xylaria feejeensis)进行液体培养,10 d后回收培养液并用乙酸乙酯萃取获得初提物,采用抑菌圈法检测蒜头果内生真菌初提物抑菌活性,同时测定了最低抑菌浓度(MIC).结果表明:白黄笋顶孢霉、大棘黑团孢、枝状枝孢菌、斑污拟盘多毛孢、赭绿青霉、淡紫紫孢菌均有抑菌活性,大棘黑团孢、斑污拟盘多毛孢、淡紫紫孢菌的初提物均对缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌和藤黄微球菌有明显抗菌活性,最低抑菌浓度在1.5625～6.25 mg·mL-1之间.这说明蒜头果树皮内生真菌的次生代谢产物具有抗菌活性,各内生真菌次生代谢产物的抗菌效果不同.

南方土壤缺磷现象较为严重,菌根真菌等共生真菌对植物吸收磷等养分具有重要的促进作用.该研究采集尾叶桉(Eucalyptus urophylla)、窿缘桉(Eucalyptus exserta)和尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)3种华南地区主要造林树种根系,采用组织分离法进行真菌分离,通过形态特征和核糖体18S rDNA基因ITS序列分析进行鉴定,经柯赫氏法则(Koch's Rule)确定桉树根系共生真菌,为桉树共生真菌理论研究和资源利用提供依据.结果表明:(1)3种桉树根系中,窿缘桉具有外生菌根(ectomycorrhizas,ECM)和丛枝菌根(arbuscular mycorrhizas,AM)结构,尾叶桉和尾巨桉同时具有AM结构、ECM结构和深色有隔内生真菌(dark septate endophytes fungi,DSE)结构.(2)3种桉树根系中分离鉴定出6种真菌:三色小皮伞菌(Marasmius tricolor)、黑柄裸脚伞(Gymnopus melano-pus)、茎点霉属(Phoma sp.)、镰刀霉属(Fusarium sp.)、二型伞霉(Umbelopsis dimorpha)和芒弗里亚拟盘多毛孢(Pestalotiopsis mangifolia).(3)6种真菌回接巨桉(Eucalyptus grandis)组培苗,三色小皮伞菌和黑柄裸脚伞形成ECM结构,为ECM真菌;茎点霉属、镰刀霉属、二型伞霉和芒弗里亚拟盘多毛孢形成DSE典型的深色有隔菌丝和微菌核结构,推测为DSE;其中2种ECM真菌为桉树中首次报道.

旨在探究林木根际细菌JYZ-SD5促生抗逆性能,以期揭示该菌在野外应用的价值.采用特定培养基定性检测该菌的固氮解磷解钾特性,测定该菌产IAA能力;平板对峙法检测菌株拮抗病原真菌活性;检测该菌重金属耐受性;将根际细菌JYZ-SD5施用于水杉盆栽幼苗,观测对水杉生长的影响;采用形态、生理生化测试及16S rRNA基因序列分析,对菌株JYZ-SD5进行种类鉴定.结果 显示,菌株JYZ-SD5具有固氮、解磷、解钾的能力;不加色氨酸前提下产IAA量可达6.818 6 μg/mL;对链格孢(Alternaria sp.)、异色状拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vesicolor)有一定拮抗活性,可产生蛋白酶和纤维素酶;对重金属Mn7+、Cr6+耐受性强,最高均可达400 mg/L;温室盆栽试验表明,根际细菌JYZ-SD5可提高水杉苗木叶绿素相对含量,对水杉株高和地径增长具有促进作用.结合形态学、生理生化和分子鉴定的方法初步确定该菌为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides).根际细菌JYZ-SD5具有良好的促生抗逆特性,具有成为新型生物菌肥的开发潜力和野外应用价值.

对一株内生真菌韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vismiae)的培养条件进行探究,在此基础上进一步对其发酵提取物抗氧化、抗菌活性进行分析.通过测定菌丝的生长速度寻找菌丝培养适宜的温度、碳源、氮源和pH,并采用正交试验优化培养条件;通过测定菌株深层发酵液提取物对羟基和DPPH自由基的清除率以分析其抗氧化活性;通过测定菌株深层发酵液提取物对多种病原细菌抑菌圈大小的影响来分析其抗菌活性.结果表明,韦司梅拟盘多毛孢菌丝最适宜培养温度为25 ℃,在该温度培养条件下菌丝生长最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母提取粉,最佳初始pH为6.5,这3种因素的显著性差异大小顺序为碳源＞氮源＞pH;菌株深层发酵液提取物具有良好的抗氧化活性,其对羟基自由基和DPPH自由基清除率的EC50分别为1.19 mg/mL和0.56 mg/mL;菌株发酵液提取物对铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用;深层发酵液提取物抗氧化和抗菌活性具有一定的稳定性.本研究结果可为深入开发利用该真菌资源提供科学依据.