目的:探究重组磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）串联显性表位（PLA2RTD）在去除原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）抗PLA2R自身抗体（anti-PLA2R）中的作用。方法:在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞体系中表达重组蛋白分子PLA2RTD（富含半胱氨酸结构域、C型凝集素样结构域1和C型凝集素样结构域7），圆二色谱法测定PLA2RTD的二级结构，酶联免疫吸附测定法和免疫荧光法测定PLA2RTD的生物活性，环氧活化法耦联重组PLA2RTD与琼脂糖凝胶CL-6B微球以制备anti-PLA2R的特异性免疫吸附剂。结果:该研究实现了PLA2RTD在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞系统中的首次表达，证明了PLA2RTD具有良好的免疫原性和较高的结合特异性。PLA2RTD免疫吸附剂体外单次吸附可平均消除76.66%的anti-PLA2R［（6.66±0.30）RU/ml比（28.54±2.10）RU/ml］，吸附完成后血浆中IgG、IgA、白蛋白、β2微球蛋白、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的含量变化<4%，第2～3次重复使用时仍可保持65%左右的吸附效率。结论:基于PLA2RTD的特异性免疫吸附剂能够有效地清除血浆中anti-PLA2R，为特异性清除与PMN相关的自身抗体提供了一种新途径。

目的:筛选表达量高且具有血凝抑制活性的B/Yamagata系流感病毒血凝素(HA)重组蛋白.方法:以B/Singapore/IN-FTT-16-0610/2016的HA为基础,在HA胞外区C末端分别融合GCN4pLL三聚化基序、GCN4pLL-半胱氨酸及GCN4pLL-七鳃鳗可变淋巴细胞受体-B(VLR-B)抗体C端的肽段序列,分别获得HA突变体基因BY-T、BY-LLc及BY-PLc;分别插入pFast-Bac1,采用杆状病毒昆虫细胞表达系统进行表达.表达鉴定后,Strep-Tactin亲和层析纯化,然后鉴定纯化突变体蛋白的寡聚程度及血凝活性.突变体蛋白免疫小鼠,检测免疫血清HA特异性IgG抗体和血凝抑制(HAI)抗体水平.结果:各HA突变体均能够有效表达,BY-T突变体表达水平最高,易于纯化,纯度好,呈多聚化形式存在;BY-LLc及BY-PLc表达水平次之,呈高聚化形式存在.三种HA突变体蛋白的血凝活性相当,均可有效诱发的HA特异性结合的IgG抗体和HAI抗体.结论:HA蛋白胞外区C端融合寡聚化基序GCN4pLL的突变体易于纯化,具有血凝活性,可诱发小鼠产生HA特异性抗体和HAI抗体.研究为B/Yamagata系流感病毒重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考.

目的 昆虫特异性病毒在白纹伊蚊中与致病性传染病病原体如登革病毒、基孔肯雅病毒和寨卡病毒等的传播和复制有着密切联系,本文对其基因组序列进行研究,为研发新型虫媒病毒防治策略提供理论基础.方法 本研究利用二代测序技术,对江西省3个口岸区域(南昌昌北机场、九江城西港和赣州陆港)采集的野外白纹伊蚊种群携带的昆虫特异性病毒进行高通量测序.结果 3个白纹伊蚊种群中广泛存在昆虫特异性病毒Aedes albopictus anphevirus(AealbAV).利用MEGAHIT软件对这些病毒reads进行组装,得到2株AealbAV全基因组序列,与美国株MW147277.1高度同源(相似度均大于98％),基因登录号分别为九江株OR715784,赣州株OR729834,南昌株仅拼接出部分序列.结论 AealbAV在江西白纹伊蚊种群中普遍存在,其全基因组研究为口岸区域利用昆虫特异性病毒进行白纹伊蚊综合防治提供了理论基础.

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1.分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3.通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测.结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2 000 bp的基因片段,与预期大小相符.昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52 000,与预期相符.WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应.结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件.

媒介昆虫可传播寄生虫和病毒,如疟原虫、寨卡病毒和登革热病毒等,每年在全球范围内造成重大的经济损失与人员伤亡.农业害虫则每年造成农作物产量的重大损失,严重威胁着全球粮食安全.然而,目前基于化学防治等手段已不足以完全控制害虫的发生与危害.同时,使用化学农药会导致抗性产生,造成环境污染和农药残留等.因此,生产上亟需开发新型害虫控制策略.近年来,随着基因组测序技术和基因编辑技术的发展,针对目标害虫种群及其特定靶标基因的遗传控制技术迅速发展.相比传统的有害生物防控手段如化学防治等,害虫遗传控制策略具有物种特异性、环境友好和防控高效等优势.本文主要综述了研究较为广泛的几种害虫遗传控制技术,包括昆虫不育技术(sterile insect technique,SIT)、昆虫显性致死释放(release of insects carrying a dominant lethal,RIDL)技术以及基因驱动(gene drive,GD)技术等的研究现状与应用案例.最后,我们对害虫遗传控制技术研究及其在农业害虫防治中的应用做出了几点展望:(1)建立稳定高效的遗传操作体系;(2)鉴定生殖细胞或其他组织中高效的启动子,以提高基因编辑或基因转化的效率;(3)解析害虫性别决定通路和挖掘参与害虫生殖发育的关键基因.

为了解云南省西双版纳傣族自治州(西双版纳州)登革热流行季节城区的媒介伊蚊携带虫媒病毒的种类,对 2018 年 8-10 月在西双版纳州城区采集的媒介伊蚊(白纹伊蚊和埃及伊蚊)和 7-11 月采集的登革病毒(dengue virus,DENV)NS1 阳性血清采用实时荧光RT-PCR进行DENV分型检测,用RT-PCR扩增DENV E基因.用 C6/36 白纹伊蚊细胞对蚊悬液进行病毒分离,对有细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)的分离物进行虫媒病毒和昆虫特异病毒 RT-PCR 检测.对阳性的 RT-PCR 扩增产物测序后采用BLAST 在线将序列与 GenBank 数据库中相似序列进行比对,用MEGA7 进行进化分析.结果从 51 组伊蚊(共1 431 只)中检测到2 组埃及伊蚊为DENV-1 阳性,从54 份血清中检测到52 份为DENV-1 阳性,得到1 条来源于埃及伊蚊和 27 条血清来源的DENV-1 E基因序列,蚊虫来源的E基因与血清来源的E基因核苷酸相似性为 97.4%～100.0%,均属于基因Ⅰ型,与近年东南亚国家流行的DENV-1 进化关系最近.从分离到的 18 株有CPE的培养液中鉴定出 17 株拉蒂纳病毒(La Tina virus,LTNV,属于黄病毒科)和 4 株砂拉越病毒(Sarawak virus,SWKV,属于T4 病毒科),其中 3 株为LTNV和SWKV同时检测阳性.本研究结果表明,西双版纳州媒介伊蚊中携带DENV、LTNV和SWKV,有必要持续开展虫媒病毒和昆虫特异性病毒的调查和研究.

目的 探讨皖南地区恙虫病的临床特征及误诊情况,为及时、有效地诊治该病提供参考.方法 以2018年1月至2023年10月皖南医学院第一附属医院收治的恙虫病病例为研究对象,收集病例人口学特征、临床表现及相关检查等资料并进行描述性分析.结果 共收治病例52例,男性和女性分别为24例(占46.15%)和28例(占53.85%);平均年龄(56.71±12.36)岁,以30～69岁为主(44例,占84.62%);职业以农民居多(26例,占50.00%).高发期为6-11月(40例,占76.92%).有明确昆虫叮咬史17例(占32.69%).临床特征以发热(52例,占100.00%)、皮疹(51例,占98.08%)、焦痂(50例,占96.15%)和纳差(38例,占73.08%)为主.实验室检测以C反应蛋白、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和D-二聚体升高为主,分别为45例(占86.54%)、33例(占63.46%)、45例(占86.54%)和47例(占90.38%).心电图多为ST-T改变、房性期前收缩、室性期前收缩,分别有17例、11例和8例;CT显示胸腔积液8例,肺部感染性病变11例;腹部超声发现肝肿大6例,脾肿大10例.病例予以左氧氟沙星或莫西沙星治疗12例,多西环素治疗40例,退热天数分别为(4.52±1.87)d和(2.71±1.08)d;住院时间分别为(6.75±2.26)d和(4.16±2.15)d;所有病例均治愈.病例平均确诊时间为(6.45±2.20)d.误诊38例(占73.08%),分别为细菌感染25例,病毒感染8例,药物性皮炎3例,风湿免疫系统疾病2例.结论 皖南地区的恙虫病患者临床表现仍是以特异性皮疹、焦痂为主,但误诊率较高.临床诊断时,应详细询问流行病学史,仔细体格检查,认真分析辅助检查,从而减少误诊的发生.

目的 研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2(PGRP-S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响.方法 将羽化后2～4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4％～8％的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠),每组60只,饱血24 h后分离中肠和其余组织,用Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将羽化后0～1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10％蔗糖溶液),每组30只,喂养5 d后分离中肠和其余组织,RT-qPCR检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将雌性斯氏按蚊分为pgrp-s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组,每组60只,分别注射pgrp-s2的双链RNA(dsRNA)和gfp基因dsRNA(69 nl/只),2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT-qPCR检测pgrp-s2的相对转录水平,提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量.分别取30只pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊,用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后,提取RNA,RT-qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量;提取pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA,转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析.使用SMART网站预测分析PGRP-S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对.克隆按蚊pgrp-s2基因,利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbac Ⅰ)在SF9细胞中表达PGRP-S2重组蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况.取10、20、40 μg/ml纯化后的PGRP-S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40 μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育,每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况,验证PGRP-S2的酰胺酶活性.结果 RT-qPCR结果显示,吸血后24 h,感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平分别为1 590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92,感染血组高于对照组(t=2.38,P＜0.05);对照组按蚊中肠的pgrp-s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04,P＜0.05).抗生素处理组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平为0.33±0.18,低于对照组的117.9±54.5(t=2.16,P＜0.05).pgrp-s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3 653±2 023,低于gfp对照组的14 982±3 892(t=2.58,P＜0.05);摩氏摩根氏菌饲喂后,pgrp-s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571 517± 61 258,低于gfp对照组的919 754±123 397(t=2.53,P＜0.05).转录组分析结果显示,pgrp-s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、mTOR通路、FoxO通路基因,下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因.10、20、40 μg/ml PGRP-S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.49±0.07、0.40± 0.10和 0.44±0.07,均低于对照的 0.90±0.09(t=3.53、3.65、3.97,均P＜0.05);但与 Lys型肽聚糖孵育 48 h后,相对A540值分别为0.52±0.03、0.62±0.03和0.65±0.04,与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、0.31、0.11,均P＞0.05).结论 斯氏按蚊体内pgrp-s2主要在中肠表达,且表达水平受共生菌调控.PGRP-S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖,具有酰胺酶活性,可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平.

疟疾、登革热、寨卡病毒病及流行性乙型脑炎等蚊媒传染病对全球公共卫生造成了严重负担.目前大部分蚊媒传染病预防与控制以媒介蚊虫控制为主.控制媒介蚊虫需要采取综合防制措施,其中生物防制如以控制有害昆虫种群为目的的昆虫不育技术,因其特异性强、安全有效、绿色环保,将成为蚊媒综合防制措施的重要组成部分.释放高质量的绝育雄虫是昆虫不育技术成功的关键保障之一,而集约化生产操作、诱导雄虫绝育的辐照,均会影响绝育雄虫的质量.蚊虫肠道内栖息着大量微生物,这些微生物在宿主的生长发育、抵御侵害、免疫调控等方面发挥着重要作用.该文综述了蚊虫肠道微生物的种类和功能,分析了肠道微生物与绝育雄蚊"致弱"的潜在关系,并展望肠道微生物在昆虫不育技术中控制蚊虫的应用前景,即利用蚊虫肠道微生物群来减缓或修复绝育雄蚊的"致弱",从而提升昆虫不育技术控制蚊媒的效率.

[目的]由于H7N9禽流感病毒能够感染鸡,并且已经变异成了高致病性毒株,因此,鸡群中H7N9禽流感疫苗的免疫是一个趋势,而鸡群免疫后抗体检测方法的建立也十分必要.本研究旨在建立一种灵敏、高效、高通量的鸡群H7N9亚型禽流感病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法.[方法]通过昆虫杆状病毒表达系统分别表达属于W1、W2-A和W2-B分支H7N9流感病毒的3种野生型血凝素(HA)蛋白,以及跨膜区(TM)置换为H3 HA TM的W2-B分支HA蛋白(H7-53TM).4种HA蛋白经过离子交换层析纯化后作为抗原,通过ELISA检测H7N9禽流感病毒抗体.[结果]ELISA特异性、敏感性和重复性试验结果显示,跨膜区置换主要影响HA蛋白ELISA检测的重复性,以H7-53TM为抗原的ELISA方法具有较好的重复性,其批内和批间变异系数小于10％,然而3种野生型HA蛋白与部分血清反应批内和批间变异系数大于10％,重复性较差,因此选择H7-53TM蛋白作为ELISA包被抗原.通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,以H7-53TM为抗原的ELISA能够精准地区分H7N9亚型流感病毒抗体阳性和阴性血清.通过相关性分析,该ELISA方法与134份鸡血清HI试验结果具有显著强相关性(r=0.854 6,P＜0.000 1),并且与3个分支疫苗株免疫血清的HI试验结果也具有显著相关性(r＞0.5,P＜0.05).[结论]跨膜区置换能够提高HA蛋白抗原检测H7N9禽流感病毒抗体的重复性,并应用跨膜区置换的HA蛋白建立了一种能够检测不同分支疫苗株免疫的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法.