利用碳水化合物结构域CBM17 将来源于Klebsiella sp.LX3 的蔗糖异构酶PalI固定于微晶纤维素表面,以获得一种经济环保、稳定性高、可循环使用的固定化蔗糖异构酶.通过无限制克隆法构建融合CBM17标签的PalI表达载体,基于CBM17 与微晶纤维素自发结合的特性,制备该酶的固定化酶;采用 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定该酶的酶活力;比较游离状态与固定化状态酶的酶学性质,衡量固定化酶的催化性能;测定固定化酶的可循环使用次数、可储存时间以对其稳定性进行评价.成功构建融合CBM17 标签的PalI,并固定于微晶纤维素表面;固定化与游离形式的PalI表现出相似的最适温度及pH,分别为 45℃、pH 6.0,而其温度稳定性及pH稳定性较游离酶均有提高,最高酶活力为(11.04±0.02)U/mg微晶纤维素(Avicel PH101);固定化酶与底物蔗糖亲和力增强,Km 为(79.94±9.56)mmol/L;该固定化酶具有良好的操作稳定性及储存稳定性,连续反应12 次,酶活力仍保持在初始酶活力的80%左右,在4℃下储存至56d时,酶活力降至 60%以下.本研究成功制备了一种环境友好、经济可行、稳定性高的固定化蔗糖异构酶,这种固定化策略为蔗糖异构酶在工业中的应用提供了一种新的思路.

[目的]旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904 木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响.[方法]通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250 法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1 和CBM4.为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1 和CBM4 通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得 4 种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4.[结果]CBM1 和CBM4 与木聚糖结合率分别为 89%和 95%.在 60℃,pH 7.0 反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4 的比活力分别是 32 274.81、49 342.21、602.48、230.42 和 2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了 1.5 倍.酶学性质分析表明,CBM1 使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在 60℃孵育 1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为 81%和 28%;在pH 3-11 范围内,CBM1-XYN在 4℃孵育 12 h后能够保持 90%以上的酶活力.[结论]在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1 和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活.

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060 bp,其中,ORF开放阅读框为1 044 bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44 kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90％;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15 d达到最高.在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反.相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平.研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用.该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础.

β-N-乙酰-己糖胺酶(beta-N-acetylhexosaminidase/beta-Hexosaminidase,HEX)是一种糖苷水解酶,在几丁质降解、N-糖基化修饰、糖复合物代谢等过程发挥重要作用.为了探究PmHEX在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得马氏珠母贝PmHEX (Pinctada fucata martensii HEX,PmHEX)cDNA全长序列并通过qRT-PCR检测其在不同组织的表达模式.结果表明,PmHEX序列全长3 812 bp,其中5'UTR为22 bp,3'UTR为364 bp,开放阅读框(ORF)为3 426 bp,编码1 141个氨基酸;预测其相对分子量为125.92 kD,理论等电点为9.06;SMART软件分析PmHEX蛋白质序列,发现它具有典型的GH20和GH20b结构域和一个碳水化合物结合结构域;多序列比对显示PmHEX与其它物种的HEX具有较高的保守性,与珠母贝HEX序列相似度高达54％;qRT-PCR表达分析显示PmH EX在外套膜各区表达量较高,且在边缘区的表达量显著高于其他组织.综上所述,PmH EX可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程.

性状(Trait)或功能性状(Functional trait)是植物、动物和微生物等对外界环境长期适应和进化后所呈现出来的可量度的特征,也是人们认识自然、利用或改造自然的重要途径和技术手段.近几十年来,科学家对植物、动物和微生物功能性状的研究取得了令人瞩目的成就,尤其在物种水平的植物叶片和根性状的研究领域;然而,自然生态系统是复杂的,植物、动物和微生物自身的多种性状间及其不同生物间性状的相互作用是广泛存在的,因此需要跨学科、系统性、集成式地调查和研究.以中国东部南北样带(NSTEC)森林生态系统为对象开展了植物、微生物和土壤性状的综合测定;基于其核心的研究结论并适当整合NSTEC前期的相关研究成果,希望能给性状研究提供新的调查模式和分析思路.沿NSTEC从热带雨林到寒温带针叶林3700km样带选取了9个地带性森林生态系统,在群落结构调查基础上对群落内所有植物种类(总计1177物种)开展了系统性的性状测定(叶-枝-千-根多元素含量,叶片形态性状-气孔性状-解剖性状-叶绿素含量-多元素含量-非结构性碳水化合物、细根形态性状-解剖性状-多元素含量等),测定了土壤微生物群落结构、酶活性、土壤有机质结构与组成、土壤碳氮周转及其温度敏感性等参数.基于上述数据,不仅按传统途径系统性地探讨了植物、微生物和土壤多种性状的纬度变异规律与影响因素;还从不同角度探讨了“如何科学地将器官水平测定性状推导至天然森林群落水平”科学难题,并从多个性状角度建立了自然森林生态系统中性状与功能的定量关系.在此基础上提出“性状网络”和“生态系统性状”概念,以其更好地用于揭示自然界复杂的森林生态系统,为验证和发展生态学理论、探讨多种性状间协同(权衡)的生态系统生产力优化机制提供重要的数据支撑.希望通过解决性状尺度拓展的技术难题,未来将传统性状研究拓展至群落或生态系统水平,并与高速发展的宏观观测手段(遥感观测、通量观测、模型模拟)有机结合,使性状研究更好地服务于区域乃至全球性的生态环境问题.

目的 运用生物信息分析工具筛选出强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)并进行文献挖掘.方法 从GEO数据库中检索获取AS患者的芯片数据,通过GEO2R进行DEGs的筛选,运用DAVID数据库对筛选获得的DEGs行基因富集和通路分析,通过STRING数据库构建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并采用Cytoscape软件行进一步分析.结果 共筛选出190个差异基因,其中上调的基因75个,下调的基因115个.GO分析显示差异表达基因主要涉及炎症反应、白细胞迁移、胞外区、细胞外结构域、细胞外区域、细胞外基质、脂蛋白颗粒结合和碳水化合物结合等功能簇;KEGG分析提示其在包括类风湿性关节炎和细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路中富集;运用STRING数据库构建蛋白相互作用网络;运用Cytoscape筛选出CXCR4、SELL、CD79A、MMP3、CD68、ADIPOQ、CCL19、IL-7R、IL-1 β、MYH14、APOE和FCGR3A等12个连接度最高基因,并运用iRegulon插件挖掘得到ETS1、GATA3和IRF8等41个作用于上述12个核心基因的转录因子.结论 新发现的12个核心基因和41个转录因子可能在AS的致病机制中起重要作用,并可能成为防治AS的新靶点.

[目的]通过两端融合表达几丁质结合结构域来提高几丁质酶的活性和生物防治植物病原真菌能力.[方法]以苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalae) ACCC40021中唯一的GH19家族几丁质酶为模板,构建两端融合表达几丁质结合结构域的几丁质酶,并进行原核表达;利用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定几丁质酶活.[结果]成功构建了CatDChiB(催化结构域)、rChiB(含N-端几丁质结合结构域)、DChBDChiB(含两端几丁质结合结构域)三种形式的酶,并在大肠杆菌中得到了高效表达;与CatDChiB和rChiB相比,DChBDchiB显著地提高了对α-几丁质、胶体几丁质和黑曲霉几丁质的结合能力和活性;同时增强了其对病原真菌长枝木霉的抑制作用.[结论]两端融合表达几丁质结合结构域是简单有效的提高几丁质酶活性及抗真菌活性的策略.

多糖利用位点(PULs)是与多糖分解代谢相关且位于特定区域的一组基因簇,包括淀粉利用系统(SusC),SusD,及编码外膜糖蛋白结合蛋白、编码碳水化合物活性酶等基因.多糖利用位点广泛存在于肠道拟杆菌中,这种能突出利用多糖的能力是拟杆菌适应肠道的生存策略之一.一方面,肠道拟杆菌的丰度高、种类繁多,是中药调节肠道菌群的最主要靶点菌群;另一方面,诸多中药化学成分中,中药多糖是重要有效成分且含量高,也可以作为肠道细菌的竞争性碳源;中药多糖如何基于碳源调节肠道拟杆菌是中药药理学研究的重要内容.本文结合最新的文献介绍了多糖利用位点的基因及蛋白构成、综述了多糖利用位点研究的最新进展,分析了多形拟杆菌和脆弱拟杆菌基因组中多糖利用位点多样性及其组成;同时,结合自己的中药多糖体外影响拟杆菌的碳源实验,对基于多糖利用位点研究中药微生态药理机制提出了展望,该方向的研究,不仅是细菌多糖利用位点研究的新内容,也是“人-药物-菌群”整体观及中医健脾研究的重要内容.

持续性内切纤维素酶(Processive endoglucanase)是一类新发现的双功能纤维素水解酶,既符合内切酶的作用特征,又具有外切酶的持续催化能力,可高效降解纤维素生成小分子寡糖.这类酶通常具有模块化结构,碳水化合物结合模块(CBM)对酶的持续催化活性及底物结合能力表现出不同的影响.综述了该领域相关研究的最新进展,分析了持续性内切酶潜在的研究方向及工业化应用的前景.

最新研究表明肠道菌群与中药药理紧密相关,微生态机制研究已成为中药药理研究的新方向.诸多的肠道菌群功能类群中,产丁酸菌是肠道菌群的一个重要功能类群,其能够发酵膳食纤维、碳水化合物、内源蛋白等产生代谢产物,其菌群的失调也与多种疾病的发生相关,因产丁酸菌的重要次级代谢产物是丁酸,而丁酸作为一种重要的短链脂肪酸,在维持肠道健康、调节免疫系统和炎症反应、调节能量代谢、影响细胞分化和凋亡上发挥着重要作用.中药多糖具有含量多、不易被宿主消化吸收但能够被肠道菌群分解利用的特点,可以作为细菌碳源,对包括产丁酸菌在内的肠道菌群进行调节,通过改善肠道菌群结构达到治疗疾病的目的.因此,基于“产丁酸菌——中药多糖”的中药药理研究,从肠道细菌的功能和从菌群碳源的多糖成分研究中药药理,是中药微生态机制研究的新领域,亟待加强.该文结合最新文献和自己中药微生态药理工作,综述了丁酸的作用、产丁酸菌利用中药多糖的分子机制、中药多糖与产丁酸菌关联性等方面的研究进展,探讨了产丁酸菌与中药多糖之间的联系,并对基于“产丁酸菌——中药多糖”的中药药理研究进行了展望,以期抛砖引玉,为基于“产丁酸菌——中药多糖”的中药药理研究进展提供参考.