目的:制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体，为后续研究奠定基础。方法:采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼，从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆，ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列，最后得到个5非冗余序列，分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株，在16 ℃下进行胞间质可溶性表达，经Ni亲和柱纯化表达后，Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果:经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×10 8 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明，5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%，且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性；4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性，在90 ℃处理后，仍能保留60%以上的结合活性。 结论:通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体，为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

起源于中始新世的骆驼科(Camelidae)是一支在北美的新生代期间演化非常成功的类群,具有很大的多样性.其中的一类约在中中新世期间经白令陆桥迁徙到亚洲,随后扩散到欧洲和非洲.虽然骆驼科在北美新生代期间演化辐射出很多种类,但从北美扩散到旧大陆的骆驼只有一个族(Camelini)的两个属:副驼(Paracamelus)和骆驼(Camelus).巨副驼(Paracamelus gigas)是我国境内最早发现的化石骆驼,一直被认为是起源于北美的Megatylopus之类的大型骆驼,然后扩散到旧大陆其他地区,最后演化成诺氏驼(Camelus knoblochi)及双峰驼(C.bactrianus).但也有学者认为骆驼属起源于非洲.最近在大连复州湾骆驼山金远洞第四纪堆积剖面的第4层中出土了一些骆驼化石,其中1件破损的头骨和带有两枚下臼齿的残破下颌骨经研究被归入巨副驼.根据对巨副驼及其他副驼种的地理及年代分布的研究,巨副驼的直接祖先应该类似于晚上新世分布在欧亚大陆的体型稍小的阿氏副驼(P.alexejevi)或相似类型.大连出产的巨副驼在形态及大小上与诺氏驼接近,但其齿列长度略大于诺氏驼且明显大于野生双峰驼(C.ferus)及单峰驼(C.dromedarius).而巨副驼与诺氏驼在地理分布上的重叠范围较大,时代分布上呈先后关系,因此可以认为巨副驼是诺氏驼的直接祖先,巨副驼在中更新世晚期通过P3收缩或简化及p3消失而演化成诺氏驼.综合化石层位的古地磁测年及花粉分析结果判断,巨副驼在早更新世的1.1～1.52 Ma期间栖息在大连半岛的森林草原环境中.

本研究运用生物信息学软件分析并通过原核表达系统诱导双峰驼TLR1(Toll-like receptors 1.TLR1)蛋白表达,制备兔抗双峰驼TLR1多克隆抗体,通过HE染色法和SABC免疫组织化学法检测其在双峰驼心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的表达.结果表明,得到的目的蛋白大小为62kDa,与预测结果相符.重组蛋白主要以包涵体的形式表达.通过间接ELISA检测抗体效价为1:64 000,Western blot检测原核表达的重组蛋白TLR1能与对应抗体特异性识别.HE和SABC免疫组化染色结果显示TLR1主要在双峰驼心脏的心肌细胞,肝脏的枯否细胞,脾脏的单核/巨噬细胞,肺脏的呼吸性细支气管上皮细胞、Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞,肾脏的远曲小管上皮细胞上呈阳性表达.综上表明,本研究成功制备的兔抗双峰驼TLR1多克隆抗体具有良好的特异反应性并能用于TLR1的免疫组化检测,且为进一步探究TLRI在双峰驼不同组织器官中所扮演的角色奠定了基础.

[背景]开发生物甲烷资源是减轻化石燃料供求紧张的有效措施,而秸秆类原料的预处理及甲烷生产方法需要不断创新,从而进一步满足可持续发展.厌氧真菌与甲烷菌共培养能够通过假根侵入及纤维降解酶双重预处理秸秆并生产甲烷,但目前全世界被报道的骆驼胃肠道来源的厌氧真菌分离培养物仅有 1 株.[目的]从新疆准噶尔双峰驼瘤胃内容物中分离出新型厌氧真菌和甲烷菌共培养物,研究其在降解秸秆并联合生产生物甲烷方面的应用潜力.[方法]采用Hungate滚管纯化技术将从骆驼胃肠道中分离的厌氧真菌和甲烷菌共培养,对其进行形态学及分子学鉴定,随后厌氧发酵 5 种底物(稻秸、芦苇、构树叶、苜蓿秆和草木樨),研究产甲烷量、降解效果及主要代谢产物等方面的特性.[结果]筛选到的共培养物中的厌氧真菌为Oontomyces sp.CR1,甲烷菌为Methanobrevibacter sp.CR1.其在降解稻秸时表现出最高的木聚糖酶酶活力(21.64 IU/mL)及甲烷产量(143.39 mL/g-DM),甲烷生产特性较分离自其他动物宿主的厌氧真菌共培养物更优.[结论]共培养厌氧真菌与甲烷菌菌株CR1 是一种新型高效降解菌株资源,其在利用木质纤维素生物质生产生物甲烷方面具有良好的应用前景.

文章首先采用细胞表达抑制状态的代谢型谷氨酸受体 5(Metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)蛋白免疫野生双峰驼,构建纳米抗体文库,运用M13 噬菌体展示技术,筛选出与mGluR5具有特异性结合的纳米抗体;其次用细胞对mGluR5蛋白进行表达纯化,然后对野生单峰驼进行 7次免疫,对抽取骆驼的外淋巴细胞总RNA进行提取,经过反转录的方式转为cDNA,将用巢式PCR对VHH片段进行扩增并与pMECS噬菌粒载体进行连接,并电转化至TG1大肠杆菌中构建纳米抗体噬菌体展示文库;其三通过M13噬菌体展示技术对文库进行淘选,淘选出多个互补决定区 3 序列不同的纳米抗体;最后纯化出纯度较高的mGluR5 蛋白,构建出库容量为 5.47×108CFU/mL的噬菌体文库菌,经过两轮液相淘选,获得了12个互补决定区3 序列不同的纳米抗体.研究成功筛选出12 个与mGluR5特异性结合较高的纳米抗体,为mGluR5 的靶向药物研发和G蛋白偶联受体的信号通路研究奠定了基础.

目的 获得靶向人CD147的纳米抗体.方法 以胞外区全长CD147蛋白为靶标,从噬菌体展示文库中筛选CD147的纳米抗体,将筛选获得的单域抗体可变区(VHH)目的基因克隆至pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达纳米抗体,使用AKTA start+GE Ni-NTA预装柱对带有组氨酸(His)标签的重组蛋白进行纯化并用酶联免疫吸附实验、生物膜层干涉技术、蛋白质免疫印迹法及激光共聚焦显微镜成像技术检测纳米抗体的特异性和亲和力.结果 经过3轮筛选获得了1个特异性结合CD147抗原的纳米抗体12-3,其亲和力达到9.46×10-9 mol/L,且可特异性地识别肿瘤细胞表面的CD147抗原.结论 从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中筛选获得了1个高亲和力抗CD147的纳米抗体,有望用于肿瘤诊断.

目的 制备能与程序性死亡受体-1(PD-1)抗原高亲和力结合的骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供实验基础.方法 采用真核表达的PD-1-Fc重组蛋白对新疆双峰驼进行6次免疫,采集其外周血并从中分离得到淋巴细胞,进行巢式PCR扩增获取骆驼重链抗体可变区(VHH)基因,并构建噬菌体展示文库.然后采用固相酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选噬菌体展示文库,包被质量浓度依次降低(5.00、2.50、1.00 μg/ml)的PD-1抗原于ELISA板中,对噬菌体展示文库进行3轮亲和淘选.接着采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选与PD-1结合的单个克隆.根据DNA测序结果挑选具有多次重复序列的3个VHH单克隆构建至pET22b载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达.最后采用镍柱亲和层析纯化重组VHH抗体蛋白,蛋白质印迹法(Western Blot)和ELISA法检测其与PD-1抗原的结合活性和亲和力.结果 采用重组蛋白PD-1-Fc对双峰驼免疫6次后,激发了高滴度的特异抗体,免疫血清效价达到1∶32 000.从免疫后的骆驼淋巴细胞构建了库容大小为2.6× 108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库.经3轮亲和筛选后,采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选获得46个吸光度(A600)值在0.6以上的单个VHH克隆.其中VHH-B7、VHH-H5和VHH-H12三个克隆序列具有较高重复,表明获得了显著富集.Western Blot及ELISA法检测结果显示,纯化的B7、H5和H12纳米抗体均与PD-1抗原具有较好的结合活性,且具有较高的亲和力,亲和力常数分别为1.19×1011、1.63×1011、1.59×1011 L/mol.结论 通过对VHH噬菌体展示文库进行亲和筛选,获得了能与PD-1抗原高亲和力结合的抗PD-1骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供了实验基础.

双峰驼IgG亚型包含IgG1、IgG2和IgG3,其中IgG2和IgG3为重链抗体,在结构上与IgG1存在显著差异.为获取双峰驼血清中的IgG1、IgG2和IgG3,并分析其抗原特异性和抗体特异性,本文交替使用Protein A和Protein G亲和层析柱,对其分离纯化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定;之后分别制备兔抗双峰驼IgG1、IgG2和IgG3的多克隆抗体,通过ELISA对制备的多克隆抗体的效价进行测定;最后应用Western blot评估这3个亚型多克隆抗体的特异性,进而对双峰驼血清中IgG1、IgG2和IgG3的抗原特异性进行分析.结果表明,应用Protein A和Protein G亲和层析柱成功分离纯化出双峰驼血清中的IgG1、IgG2和IgG3;并制备兔抗双峰驼IgG1、IgG2和IgG3的多克隆抗体效价均在1:10000以上,且所获得的多克隆抗体分别与IgG1、IgG2和IgG3之间均存在交叉反应,但兔抗双峰驼IgG1多克隆抗体较其它两个亚型多克隆抗体特异性低.结果证明,双峰驼IgG1、IgG2和IgG3均具有良好的免疫原性,三者结构虽存在显著差异,但其抗原特性类似.

目的:构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证.方法:采用Oligo DT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录,通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因,将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体,经多次电转化至E.coil TG1构建初级噬菌体抗体库,经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库,并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定.同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛,计算淘筛回收率,并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定.结果:构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95％左右,随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66.17％,经MEGA分析后具有较好的多样性,同时经辅助噬菌体拯救后,得到的噬菌体展示库滴度为4×1012CFU/ml.在三轮淘筛过程中,回收率逐步升高,噬菌体得到了有效的富集,同时对阳性克隆进行测序及分析,最终得到2条抗GDH纳米抗体序列.结论:成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好,为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础,同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列,为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑.

[目的]建立黑须污蝇Wohlfahrtia magnifica转录组数据库,挖掘黑须污蝇基因数据,为更深入地研究双峰驼阴道蝇蛆病提供理论依据.[方法]采用高通量测序平台Illumina HiseqTM4000对黑须污蝇幼虫、蛹和成虫进行转录组测序,并进行生物信息学分析.利用黑须污蝇幼虫、蛹和成虫转录组数据,通过基因差异表达分析以及GO功能显著性富集分析的方法筛选出嗅觉相关基因,并通过荧光定量PCR技术对黑须污蝇幼虫、蛹和成虫中OBP99b,OBP56a和OBP99a3个嗅觉相关基因表达水平进行验证.[结果]结果显示,每个黑须污蝇样本的转录组数据量在4.96 Gb以上,G+C含量在35.35％以上,Q20含量在97％以上.与NCBI_nr,GO,KEGG,Pfam,Swiss-Prot和eggNOG数据库进行对比,共注释到73 303条unigenes.其中eggNOG数据库注释到的unigenes最多,为35 066条,分布在23个蛋白功能中,其中的翻译修饰、蛋白质周转的unigenes所占比例较大;GO数据库注释到的unigenes数为29 193条,功能包括分子功能、细胞组分、生物学过程三大类50个分支,其中参与生物学过程和氧化还原过程的unigenes比例较大;KEGG数据库注释到的unigenes数为15 068条,其中参与信号转导过程的unigenes比例较大.上述数据表明该转录组测序结果较好,为后续研究奠定了基础.依据黑须污蝇幼虫、蛹、成虫转录组数据筛选到30个嗅觉相关基因,其中包含9个气味结合蛋白(OBP)基因,进一步基因注释发现OBP99b,OBP56a和OBP99a基因在黑须污蝇不同发育阶段表达差异显著(| log2FC |＞1,P＜0.05),这在荧光定量PCR分析结果中得到了验证.[结论]本研究获得了黑须污蝇幼虫、蛹和成虫转录组数据,筛选出黑须污蝇各发育阶段嗅觉相关基因,并验证了OBP99b,OBP56a和OBP99a基因在黑须污蝇幼虫、蛹和成虫3个发育阶段差异表达,为防治双峰驼阴道蝇蛆病提供了新思路.