木质纤维素生物质是一种量大面广且廉价易得的可再生资源,已逐步实现由生物质向生物燃料、饲料原料和其他附加值产品的开发及应用,这样的高值转化与综合利用成为"走绿色发展道路、构建绿色生产体系"的重要部分.然而,木质纤维素的天然抗降解屏障及其独特的理化性质,纤维素-半纤维素-木质素三大组分的刚性网络一直是高效转化的瓶颈所在,合理有效的预处理技术则是资源化进程的关键步骤.本文落脚于木质纤维素生物质的基本组成和结构特性分析,在总结物理法、化学法、生物法等传统预处理方法优劣势的基础上,着重阐述了蒸汽爆破的发展历程、加工类型、适用范围、工作原理、反应阶段、技术特点、影响因素、主要参数和可能的副产物效应等,以及在生物质的纤维改性、结构变化、溶解特性、低聚糖制备、活性成分提取与反刍饲料化利用层面的研究进展.此外,还指出蒸汽爆破辅以真菌、细菌为主的微生物发酵,以及糖酶外源添加的后处理流程的发展趋势.最后,归纳了蒸汽爆破在未来商业化、工业化和规模化生产推广中可能面临的困难和挑战,分析提出相应的突破点和解决策略.并就蒸汽爆破技术对常见副产物类型饲料原料的降解效果,及其在单胃动物日粮中的合理应用进行展望,以期为该技术对生物质资源的开发、增值、饲料化应用的诸多潜能提供新思路和技术指导.

[背景]作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛.来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)的GH10 家族木聚糖酶CbXyn10C最适温度为 85℃,在 80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力.[目的]为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶CbXyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理.[方法]以CbXyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排 2 种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在 100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制.[结果]共获得了 4 个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优.随着在A45P基础上另外 3 个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升.获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型分别提高了 5℃和 6.8℃.分子动力学模拟技术分析发现 4 个位点的突变引入了新的氢键作用力且优化了疏水作用网络,进而导致酶的结构构象更加稳定.[结论]本研究不仅提高了木聚糖酶在饲料工业中的应用价值,而且对基于酶蛋白结构的稳定性分子改造提供了理论支持.

为了揭示我国不同蜜环菌Armillaria 的木腐特性,本研究以我国 8 个蜜环菌种为材料,采用蜜环菌液接种 1 cm3 的枹栎Quercus serrata木方,置于 23℃下培养 60 d和 120 d,采用重量法、Klason法、硫酸水解法和盐酸水解法测定木材质量、纤维素含量、木质素含量和半纤维素含量,研究各蜜环菌株的木腐能力及差异性.结果表明,各蜜环菌种对枹栎木质量损失率排序为:CBS M(A.borealis)>CBS A(A.sinapina)=CBS J(A.qinii)=CBS H(A.bruneocystidia)=CBS F(A.sinensis)=CBS B(A.gallica)>CBS N(A.violacea)=CBS D(A.ostoyae);木质素的分解能力排序为:CBS M=CBS A=CBS J>CBS H=CBS B=CBS F>CBS N>CBS D;纤维素降解利用率排序为CBS H=CBS A>CBS B>CBS J>CBS F>CBS D>CBS M>CBS N;半纤维素分解能力排序为:CBS M>CBS J>CBS H=CBS A=CBS F=CBS N>CBS B>CBS D;木质纤维素总量消耗排序为:CBS H>CBS A>CBS J>CBS B>CBS F>CBS M>CBS D>CBS N.我国主要蜜环菌的木腐能力在木腐真菌类群中处于中等以下水平.在蜜环菌属内,各菌种之间腐朽能力的多样性表现为对凋落物不同组成降解能力存在显著的差异和腐朽类型的可变性,其形成的原因可能与其适应森林生态系统物种多样性有关.本研究可为理解森林生态系统中凋落物的降解和碳循环的机理提供部分理论指导,同时为我国天麻栽培蜜环菌选育提供参考.

以双核香菇Lentinula edodes菌株中分离获得 2 个亲和的单核体Y0040-1 和Y0040-3 为材料,在不同的培养基上进行培养,进行差异性状评价和表达差异性分析.结果表明在不同的培养基(PDA和 2%木屑PDA)上 2 个单核体菌丝生长速度都存在差异,其中Y0040-1 的生长速度显著高于Y0040-3.进一步分析转录组数据发现,在不同培养基上 2 个单核体比较组(Y0040-3 vs.Y0040-1)有1 633 个共同的差异基因,这些共同变化的基因可能是导致两者性状差异的主要原因,这些基因中共同上调的有 155 个,共同下调的有 136 个.对这些基因进行注释分析,发现共同上调的基因参与代谢过程中的氨基酸代谢和碳水化合物代谢等,分析木质纤维素酶发现,Y0040-1 上调基因数量高于Y0040-3,且Y0040-1 中的纤维素降解酶和木质素降解酶表达量都明显高于Y0040-3.

[目的]分析广叶绣球菌(Sparassis latifolia)在不同木质纤维素诱导条件下基因表达差异,为广叶绣球菌木质纤维素降解关键基因和分子机制研究提供参考.[方法]以松木、杉木、甘蔗渣和天然堆积发酵后的杉木和发酵后的甘蔗渣为碳源,在液体培养条件下培养诱导广叶绣球菌,对其转录组进行测序研究,并对不同木质纤维素诱导样本进行加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA).[结果]杉木培养与松木培养比较组差异表达基因最少(20个),蔗渣培养与松木培养比较组差异表达基因最多(486个).基因本体(gene ontology,GO)富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及氧化还原酶活性、单加氧酶活性和铁离子结合活性等,京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及戊糖和葡萄糖醛酸转换、甲烷代谢和乙醛酸盐和二羧酸盐代谢等通路.发酵甘蔗渣为碳源培养时,纤维素和半纤维素降解相关的糖苷水解酶基因表达量总体上较高,而未发酵的松木、杉木和甘蔗渣为碳源培养时木质素降解或修饰相关的碳水化合物辅助酶基因表达量总体上较高.利用WGCNA共鉴定出10个共表达模块,其中green模块与未发酵蔗渣诱导显著正相关,blue模块与发酵甘蔗渣诱导显著正相关,magenta和turquoise模块与发酵杉木诱导显著正相关.GO富集分析结果表明,turquoise模块内基因显著富集到尿素跨膜转运子活性、甲基转移酶活性和单加酶活性等,blue模块基因显著富集到水解酶活性和β-甘露糖苷酶活性.KEGG通路富集分析结果表明,blue模块内基因显著富集的通路有半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等.通过构建互作网络图挖掘到12个核心基因,其可能参与了基质降解及相关基因的表达调控.[结论]不同木质纤维素类型显著影响了广叶绣球菌木质纤维素降解基因的差异表达轮廓,这种差异反映了广叶绣球菌对不同木质纤维素特异的降解策略.

[目的]为挖掘新型裂解性多糖单加氧酶(LPMO)酶资源,探究LPMO在辅助降解纤维素过程中起到的重要作用.[方法]从Thermothelomyces thermophilus基因组中克隆表达了一个新型LPMO酶TtLPMO9I,系统地分析了其序列及结构的进化特征;采用DNS法表征了TtLPMO9I的酶学性质;在反应体系中添加不同浓度的抗坏血酸探究外部电子供体对TtLPMO9I活性的影响;以玉米秸秆和微晶纤维素为底物,通过检测还原糖的生成量计算获得TtLPMO9I与纤维素酶的协同作用效果.[结果]TtLPMO9I在 60℃,pH 5.0 时表现出最佳酶活力.在 60℃孵育 12 h后,仍能剩余 54%的活性.经pH 6.0-8.0 处理 12 h后,酶活无损失.添加外部电子供体抗坏血酸使TtLPMO9I的活性提高至 184%.在玉米秸秆和微晶纤维素降解过程中,TtLPMO9I与纤维素酶表现出良好的协同作用效果.将 50-200 μg的TtLPMO9I添加至降解体系中,还原糖产量分别提高了 34%-142%和 6%-46%.[结论]TtLPMO9I不仅具有良好的温度稳定性和pH稳定性,在木质纤维素的降解过程中也具有突出的作用效果,为工业生产应用提供了潜在的优质酶资源.

本研究旨在从深海环境中分离、筛选木质素高效降解真菌并分析其对木质素的降解过程.通过对西太平洋深海沉积物和海水样品中可培养真菌的分离筛选,成功获得了一株能够以木质素为唯一碳源生长的真菌菌株CS1,通过ITS基因序列鉴定,确定其为毛壳菌属Chaetomium sp.真菌.菌株CS1以碱性木质素为唯一碳源培养14 d,木质素降解率达到64%,同时菌株孢子能够在较广的pH 范围内萌发生长(pH 4.0-9.0).该菌株具有分泌多种胞外木质素降解酶的潜力,能够使苯胺蓝褪色并使愈创木酚产生棕红色氧化圈.红外光谱(FTIR)分析显示,菌株CS1对木质素的降解主要是对木质素的芳香族骨架、β-O-4的C-O键以及β或γ位的O-H造成破坏.此外,菌株CS1可在烟草秸秆表面形成生物膜以实现木质素的降解与转化,而 GC-MS 分析结果表明该菌株能够促进烟草秸秆中烟碱类活性物质的释放,并将木质素中的芳香族聚合物转化为二甲苯等石化工业基础原料.本研究结果揭示了海洋真菌对烟草秸秆类木质纤维素的降解潜力,为木质素废弃物的资源化利用提供了优良的菌种资源.

由于香菇菌糠纤维素含量过高,作为菌肥难以被农作物直接利用,为了更好地解决香菇菌糠降解缓慢的问题,本研究以菌株酶活力和菌糠失重率为指标对 8 株真菌和 6 株细菌菌株进行香菇菌糠降解优选菌株的筛选,确定了降解能力较高的 2 株真菌和 2 株细菌,分别为桦褶孔菌 Lenzites betulina和一色齿毛菌Cerrena unicolor,无丙二酸柠檬酸杆菌Citrobacter amalonaticus和变栖克雷伯氏菌Klebsiella variicola;在此基础上研究这4株菌在降解香菇菌糠过程中降解酶活、纤维素、半纤维素、木质素以及主要营养成分的动态变化和肥力测定.研究结果显示,桦褶孔菌对木质素降解效果显著,降解率达到 56.35%;无丙二酸柠檬酸杆菌对半纤维素降解效果良好,达到 61.51%.通过对全碳、全氮的测定,发现 4 种菌株降解后的菌糠氮含量均高于对照组,表明加入菌剂后在一定程度上缓解了氮元素的损失量,增加了菌糠肥力.本研究通过比较研究不同类型的微生物对菌糠降解的理化特征,明确真菌和细菌在菌糠降解过程中具有不同的功能特征,为今后对香菇菌糠发酵堆肥、制备微生物复合菌剂研究方面提供重要的参考价值.

纤维素乙醇作为一种清洁可再生的绿色能源,具有良好的应用前景.然而酿酒酵母利用木质纤维素原料生产乙醇的发酵过程易受多种抑制物胁迫的影响,因此提高其胁迫耐受性具有重要意义.本研究在细胞内设计了一种氧化还原敏感型基因元件,通过生物传感器Yap1 感应胞内氧化还原状态,以调控抗胁迫基因智能表达.首先,分析了Yap1 调控的天然内源启动子PTRR1、PTRX2 和PMET16 对木质纤维素水解液中典型抑制物的响应强度.其次,根据不同胁迫种类组合相应启动子与抗胁迫的效益基因,构建氧化还原敏感型基因元件提高了酿酒酵母的胁迫耐受性.最后,将表现较好的基因元件GP-CTT和GP-ADH串联整合到一起构建了双基因元件系统,在 5-HMF和H2O2 双重胁迫下细胞的死亡率与野生型相比下降了 69.6%.相较于单基因元件GP-CTT,双基因元件整合菌株的比生长速率、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率分别提高了64.2%、60.1%和 58.9%,重组菌株过氧化氢酶的酶活力提高了 40.2%.本研究通过理性设计氧化还原敏感型基因元件的遗传回路,强化胞内关键抗氧化酶和醛降解途径,系统地提高了酿酒酵母的胁迫耐受性,为动态地提高酵母鲁棒性提供了新的见解.

反刍动物瘤胃是自然界中最有效的纤维素降解系统,其纤维素降解能力主要源于寄居于其中的纤维素降解细菌、真菌和原虫.其中,瘤胃纤维素降解细菌因数量庞大、种类繁多以及代谢途径丰富,在木质纤维素降解及利用方面发挥着重要作用.本文综述了国内外瘤胃纤维素降解细菌的种类,分析了瘤胃纤维素降解细菌的特性;阐述了瘤胃纤维素降解细菌通过纤维小体对纤维素的降解过程,以及瘤胃微生物之间的相互作用和相互制约关系;简述宏组学技术在开发新纤维素降解菌和新纤维素酶方面的应用,旨在为进一步研究纤维素降解细菌的降解机理,开发新的纤维素菌种和酶资源提供新的思路.