肺淋巴管肌瘤病（PLAM）是一种好发于育龄期女性的低度恶性肿瘤性疾病，有效动物模型的缺乏一直是其机制研究的瓶颈。现有PLAM动物模型包括注射结节性硬化症复合体基因2（TSC2）缺失肿瘤细胞的移植瘤小鼠模型和TSC基因敲除的转基因小鼠模型，其中移植瘤小鼠模型包括同种异体移植瘤、人源化异种移植瘤和大鼠源性异种移植瘤，转基因小鼠模型包括胚系基因敲除和条件性基因敲除小鼠。部分PLAM动物模型存在PLAM样肺部病变，主要用于寻找PLAM新的治疗靶点和PLAM肿瘤细胞来源，但并不能完全代表PLAM患者的疾病发展。本文总结了目前所有PLAM动物模型的特点及临床应用情况，并结合笔者研究经验着重分析近6年的研究进展，以期供该领域学者参考。

严重烫伤后肠道缺血缺氧会引起肠上皮屏障受损，发生肠道细菌移位（EBT），从而导致严重的并发症，如SIRS、脓毒症和MOF的发生。囊性纤维化穿膜传导调节蛋白（CFTR）可因肠上皮细胞缺氧而表达下调，进而影响紧密连接蛋白的正常结构与功能，而紧密连接蛋白正是维持肠道屏障的关键结构。陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军烧伤研究所陈婧老师团队联合上海交通大学第九人民医院整复外科章一新教授团队近期在《Burns & Trauma》发文《Molecular mechanism mediating enteric bacterial translocation after severe burn: the role of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator》，使用人Caco-2细胞系建立体外缺氧损伤模型，并建立C57小鼠严重烫伤模型，研究严重烫伤对小鼠肠黏膜屏障、CFTR和紧密连接蛋白表达的影响，同时选取DF 508小鼠（F508del CFTR基因突变小鼠）为体内模型，进一步证明CFTR在维持小鼠正常肠道屏障功能中的作用。研究结果显示，在缺氧条件下，人Caco-2细胞中CFTR的表达显著降低；胞外信号调节激酶（ERK）和核因子κB信号被激活；炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8）分泌增加；带状闭合蛋白1（ZO-1）、闭合蛋白和E-钙黏合素的表达下调；跨上皮电阻值降低；并导致ZO-1在细胞膜上分布不连续，排列不规则。同样地，敲除CFTR导致了相似的改变，且敲除CFTR引起的炎症因子的上调和紧密连接蛋白（ZO-1和闭合蛋白）的下调，可以通过抑制特定的ERK或核因子κB而逆转。与此同时，在严重烫伤小鼠的肠道中观察到大量的促炎症介质分泌和EBT，进一步支持了体外实验结果。与野生型小鼠相比，DF 508小鼠回肠中的TNF-α、IL-1β和IL-8浓度升高。此外，维生素D3被证明可以保护肠道上皮屏障免受缺氧损伤，机制可能与其上调CFTR表达，从而抑制ERK通路激活，减少促炎性细胞因子释放有关。此项研究结果表明，严重烫伤后，肠上皮细胞通过CFTR/ERK/促炎性细胞因子途径调节细胞间紧密连接蛋白的表达，进而调节肠道菌群移位，维生素D3可对严重烫伤后的肠黏膜屏障起到保护作用。

目的:构建并鉴定气道上皮细胞条件性Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）基因敲除小鼠，观察慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）患者气道上皮SHP-1表达情况及SHP-1表达缺陷对肺气肿小鼠表型的影响。方法:检测慢阻肺患者肺组织中气道上皮SHP-1的表达情况。采用CRISPR/Cas9技术构建SHP-1 flox/flox转基因小鼠，并将其与气道上皮细胞Clara蛋白10-环化重组酶与雌激素受体融合转基因小鼠（CC10-CreER +/+）进行交配，腹腔注射他莫昔芬后，获得气道上皮SHP-1基因敲除小鼠（SHP-1 flox/floxCC10-CreER +/-，SHP-1 Δ/Δ）。提取小鼠鼠尾和肺组织DNA，经PCR扩增后判别小鼠的基因型；通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光等方法验证气道上皮细胞SHP-1基因的敲除效果。使用弹性蛋白酶构建肺气肿小鼠模型，评估各组小鼠肺气肿严重程度。 结果:慢阻肺患者气道上皮SHP-1表达显著下调。基因型鉴定证实SHP-1 Δ/Δ小鼠表达CC10-CreER及SHP-1-flox。他莫昔芬诱导后，我们从DNA、RNA及蛋白水平证明SHP-1 Δ/Δ小鼠气道上皮细胞中SHP-1蛋白表达缺失，表明气道上皮细胞特异性SHP-1基因敲除小鼠构建成功。肺气肿动物模型中，SHP-1 Δ/Δ小鼠与对照组相比，肺气肿表型更为严重，表现为肺组织肺泡结构紊乱，肺泡壁破裂融合形成肺大疱。 结论:本研究成功建立并鉴定气道上皮细胞SHP-1基因敲除小鼠模型，为深入阐明SHP-1在慢阻肺进程中的作用及其机制提供了新的实验工具。

目的:探讨Cre-loxP重组酶系统构建的兴奋性神经元腺苷酸活化蛋白激酶α1( AMPKα1)基因特异性敲除模型小鼠大脑能量代谢及认知功能的改变。 方法:将杂交繁育获得的16只基因型为 AMPKα1 flox/flox/Camk2a-Cre/ERT2 的6月龄小鼠按随机数字表法分为 AMPKα1敲除组( n=8)与 AMPKα1野生组( n=8)， AMPKα1敲除组小鼠每天腹腔注射0.1 mL他莫昔芬(20 mg/mL，溶于玉米油)以控制 AMPKα1基因在兴奋性神经元中的敲除， AMPKα1野生组小鼠每天腹腔注射等量玉米油以作对照。连续注射5 d，并等待7 d后分别采用Morris水迷宫和T迷宫实验检测2组小鼠的空间学习记忆及空间工作记忆能力，采用化学交换饱和转移成像(CEST)观察2组小鼠海马及海马周围皮层的葡萄糖代谢情况，采用Western blotting实验检测2组小鼠海马及海马周围皮层的AMPKα1、谷氨酸受体1(GluR1)蛋白表达情况。 结果:与 AMPKα1野生组比较， AMPKα1敲除组小鼠第3、4天的逃避潜伏期明显延长[(13.90±3.72) s vs. (22.40±6.28) s；(11.95±3.86) s vs. (22.39±9.77) s]，穿越平台次数明显减少[(5.25±1.83)次 vs. (1.75±1.28)次]，自由交替率明显降低[(73.21±9.16)% vs. (48.21±11.29)%]，海马及海马周围皮层的葡萄糖代谢水平明显降低(2.77±0.67 vs. 1.51±0.81；2.42±0.95 vs. 1.31±0.83)，海马及海马周围皮层AMPKα1、GluR1蛋白表达明显降低(AMPKα1：0.70±0.05 vs. 0.49±0.03，0.98±0.04 vs. 0.64±0.06；GluR1：1.22±0.18 vs. 0.60±0.11，0.96±0.08 vs. 0.79±0.04)，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:特异性敲除兴奋性神经元 AMPKα1基因可导致小鼠大脑葡萄糖代谢异常，从而引起其认知功能障碍，其机制可能与能量代谢障碍引起兴奋性突触障碍有关。

目的:初步探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与多配体蛋白聚糖1(SDC1)在缺氧胶质瘤细胞增殖及替莫唑胺(TMZ)化疗抵抗调控中的相互作用。方法:将U87细胞分为常氧组、常氧+TMZ组、常氧空载组、常氧空载+DMSO组、常氧空载+TMZ组、常氧SDC1过表达组、常氧SDC1过表达+TMZ组，缺氧组、缺氧+TMZ组、缺氧空载组、缺氧敲除HIF-1α组、缺氧敲除HIF-1α组+TMZ、缺氧SDC1干扰组、缺氧空载+DMSO组、缺氧空载+TMZ组、缺氧SDC1干扰+TMZ组。采用低氧探针检测细胞缺氧情况；TMZ处理72 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡情况；敲除HIF-1α后，于缺氧条件下培养细胞并给予TMZ处理2 、4 、6 、8 d，检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放及细胞凋亡。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(WB)法检测细胞HIF-1α、SDC1基因和蛋白质的表达量；采用染色质免疫共沉淀(ChIP)-qPCR(ChIP-qPCR)法检测HIF-1α与SDC1启动子结合情况。分析中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库(321例)、基因表达谱数据交互分析(GEPIA)数据库(681例)的肿瘤标本，分析HIF-1α和SDC1基因在不同级别脑胶质瘤中的表达情况，以及高、低表达SDC1脑胶质瘤患者生存期的差异；HIF-1α与SDC1基因在脑胶质瘤标本中表达的相关性。结果:低氧探针检测证实缺氧组细胞处于缺氧状态。CCK-8和流式细胞术检测显示，与常氧+TMZ组比较，低氧+TMZ组细胞的存活率高、凋亡率低(均 P<0.01)。WB检测显示，与常氧组比较，缺氧组细胞的HIF-1α表达高( P＝0.040)；缺氧敲除HIF-1α组HIF-1α的表达量低于缺氧空载组。缺氧敲除HIF-1α+TMZ组的LDH释放量和细胞凋亡率均高于缺氧空载+TMZ组(均 P<0.01)。RT-qPCR检测显示，与缺氧空载组比较，缺氧敲除HIF-1α组的SDC1 mRNA表达量下降；WB检测显示，缺氧敲除HIF-1α组SDC1蛋白的表达降低(均 P<0.01)；CCK-8检测显示，常氧空载+TMZ组的细胞数量低于常氧空载+DMSO组和常氧过表达SDC1+TMZ组(均 P<0.01)；缺氧干扰SDC1+TMZ组和缺氧空载+TMZ组的数量均低于缺氧空载+DMSO组(均 P<0.01)，而缺氧干扰SDC1+TMZ组细胞数低于缺氧空载+TMZ组( P<0.01)。流式细胞术检测显示，常氧过表达SDC1+TMZ组细胞凋亡率显著低于常氧空载+TMZ组( P＝0.030)，而缺氧干扰SDC1+TMZ组细胞凋亡率显著高于缺氧空载+TMZ组( P<0.01)。ChIP-qPCR分析显示，HIF-1α在SDC1启动子上的－1314~－1310处存在结合位点。GEPIA、CGGA数据库的数据分析结果显示，在脑胶质瘤组织中HIF-1α、SDC1的表达水平高于非肿瘤脑组织，且随着胶质瘤WHO级别的增高表达水平相应升高(均 P<0.05)。脑胶质瘤组织的HIF-1α与SDC1 mRNA的表达呈正相关( P<0.05)。低表达SDC1组患者的生存期长于高表达SDC1组( P<0.01)。 结论:缺氧条件下，HIF-1α作为转录因子经SDC1促进胶质瘤细胞的增殖及TMZ的化疗抵抗。

目的:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术建立多囊肾病1（polycystic kidney disease 1， Pkd1）基因条件敲除小鼠模型，为深入研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用提供动物模型。 方法:采用In-Fusion技术构建打靶载体，根据 Pkd1基因制备对应的gRNA、Cas9 mRNA及携带loxP位点的供体载体，共同注射于C57BL/6N小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经PCR鉴定及测序分析分选出 Pkd1 flox/flox基因型F0代阳性小鼠，后者与野生型小鼠配繁，筛选出后代基因型为 Pkd1 flox/+的F1代杂合子小鼠，内部扩繁获得基因型为 Pkd1 flox/flox的F2代纯合子小鼠，该基因型小鼠再与 Cre阳性表达的 Ggt1- Cre小鼠杂交，获得 Pkd1 flox/+Ggt1 Cre基因型的F3代小鼠，F3代自交或与F2代 Pkd1 flox/flox回交得到 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre基因型的F4代小鼠，即肾脏特异性 Pkd1基因敲除（ Ggt1-cKO）小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型，按基因鉴定结果分为野生型对照（WT）组（ n=6）、 Pkd1纯合子对照（PKD）组（ n=6）和 Ggt1-cKO敲除验证（CKO）组（ n=6）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组小鼠肾脏和其他器官组织中 Pkd1 mRNA的表达；HE染色检查各组小鼠肾组织病理改变；自动生化检测仪检测小鼠血清尿素氮和血清肌酐含量，并计算肾脏系数。 结果:PCR检测结果显示，CKO组子代小鼠基因型符合 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre。 Pkd1基因仅在肾脏特异性表达，其余组织中均未见表达。RT-qPCR结果显示，CKO组小鼠肾脏髓质 Pkd1 mRNA相对表达量显著低于WT组和PKD组（均 P<0.05）。肉眼可见CKO组小鼠肾脏体积较WT组增大了1倍左右，光镜下可观察到CKO组小鼠肾脏有多个大小形态不一的空泡，髓质组织间隙明显增加。CKO组小鼠肾脏系数、血清尿素氮和血清肌酐含量均显著高于WT组和PKD组（均 P<0.05）。 结论:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术可成功构建 Pkd1基因条件敲除小鼠，为进一步研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用机制提供动物模型。

目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法:利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中 HSF1基因，构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(ARPE/Hsf1 －/－)，分别命名为H8、H9细胞株。取野生型、H8和H9细胞株，应用DHE探针染色结合流式分析技术测定细胞内活性氧簇(ROS)含量，应用流式细胞分析方法测定细胞周期；采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同培养时间点细胞活力值；采用结晶紫染色实验测定细胞相对存活率；采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验检测衰老细胞比率；采用Western blot法检测各细胞株中热休克蛋白(HSP)70、HSP27、聚集素(CLU)、p53、p21和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平；采用实时荧光定量PCR法测定各细胞株中p53、p21、IL-6、IL-8、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA表达水平。比较各细胞株在不同热休克处理条件下和HSP90抑制剂IPI504处理下热休克反应相关蛋白相对表达量，比较各细胞株不同浓度H 2O 2处理后相对存活率，比较各细胞株经或未经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后p21蛋白相对表达量。 结果:基因测序显示H8和H9细胞株成功携带突变基因，Western blot检测结果显示H8、H9细胞株不表达HSF1蛋白，HSF1在ARPE-19细胞中被成功敲除。与野生型细胞株相比，H8、H9细胞株中的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；各细胞株HSP90蛋白相对表达水平总体比较，差异无统计学意义( F＝0.29， P>0.05)。在不同热休克刺激和IPI504诱导下野生型细胞株中HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与野生型细胞株相比，H8和H9细胞株的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著低于相应处理的野生型细胞，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与野生型细胞株相比，H8和H9细胞株培养24、48、72和96 h的细胞活力均显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与野生型细胞株比较，H8和H9细胞株G1期细胞百分比显著升高，细胞周期抑制因子p53、p21的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，SA-β-gal染色阳性细胞比率显著增加，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；衰老相关炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、MCP1 mRNA相对表达量显著下降，差异均有统计学意义(均 P<0.001)。H8和H9细胞株ROS含量明显高于野生型细胞株，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；H8和H9细胞株经NAC处理后p21蛋白相对表达量较未经NAC处理明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。H8和H9细胞株200、400、600、800 μmol/L H 2O 2处理条件下细胞相对存活率明显低于野生型细胞，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:敲除HSF1可下调HSP的表达，激活ROS/P53/P21通路，诱导RPE细胞衰老，并增加RPE对氧化应激刺激的敏感性。HSF1在RPE细胞中可能具有抗衰老和抗氧化调控作用。

目的:采用基因敲除法评价海马载脂蛋白E(ApoE)在年龄因素影响多次七氟烷麻醉小鼠远期认知功能中的作用。方法:幼年(6日龄)及成年(60日龄)雌性野生型(WT)C57BL/6J小鼠72只、ApoE基因敲除型(ApoE-KO)C57BL/6J小鼠56只，幼年小鼠体重3～5 g，成年小鼠体重20～25 g。采用随机数字表法将WT小鼠和ApoE-KO小鼠分别分为4组(WT小鼠每组18只，ApoE-KO小鼠每组14只)：幼年对照组(P6＋C组)、幼年七氟烷组(P6＋S组)、成年对照组(P60＋C组)及成年七氟烷组(P60＋S组)。七氟烷组每天吸入3%七氟烷及60% O 2 2 h，连续3 d，对照组则置于相同环境，每天吸入60% O 2 2 h，连续3 d。于七氟烷麻醉结束当天(出生后8或62 d)每组随机选取4只小鼠，采用ELISA法检测海马IL-1β、IL-6和TNF-α含量；WT小鼠各组随机取4只，采用Western blot法检测海马完整长度ApoE和ApoE碎片段的表达水平；每组随机取10只小鼠进行标准化饲养，于七氟烷麻醉后22 d(出生后30或84 d)进行条件恐惧实验。 结果:WT小鼠：与P6＋C组比较，P6＋S组海马TNF-α、IL-6和IL-1β含量升高，完整长度ApoE和ApoE碎片段表达上调，僵直时间缩短( P<0.05)，P60＋C组与P60＋S组上述指标比较差异无统计学意义( P>0.05)；ApoE-KO小鼠：P6＋C组与P6＋S组比较、P60＋C组与P60＋S组比较海马TNF-α、IL-6、IL-1β含量和僵直时间差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:年龄因素影响多次七氟烷麻醉小鼠远期认知功能障碍的机制与上调海马ApoE表达，诱发神经炎性反应有关。

目的:构建间质细胞双尾C(Bicc1)基因条件性敲除小鼠模型，并对其表型进行分析。方法:将CRISPR Cas9方法构建的Bicc1 f/+小鼠子代与Pdgfra启动子驱动的Cre小鼠进行杂交，获得子代小鼠，饲养1~2周后提取其脚趾及鼠尾组织基因组DNA，经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，在DNA水平检测小鼠基因型；选取经鉴定后生长至3周龄的Bicc1基因条件性敲除小鼠(实验组)、野生型小鼠(对照组)各3只进行后续实验：通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导敲除Bicc1基因，于1周后取小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤及脂肪组织，一部分组织通过实时定量PCR(RT-qPCR)鉴定其中的Bicc1 mRNA表达水平；另一部分组织以10%多聚甲醛固定，随后进行HE染色和Masson染色，在光镜下观察分析。应用SPSS 28.0软件对数据进行分析，组间比较采用 t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:通过繁育获得间质细胞Bicc1基因条件性敲除小鼠，基因型为Bicc1 f/fCre +/－，野生型小鼠基因型为Bicc1 f/fCre －/－；RT-qPCR检测结果显示，实验组小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤、脂肪组织中Bicc1 mRNA表达水平均显著低于对照组( P均<0.01)；HE染色和Masson染色显示，与对照组相比，实验组小鼠肾小球萎缩，肾小囊形状不规则，部分肾小囊消失；骨骼肌纤维排列疏松散乱，肌纤维堆积不致密；皮肤及脂肪组织未见明显差别。 结论:成功建立了间质细胞Bicc1基因条件性敲除小鼠模型，可以为研究Bicc1基因在组织器官间质细胞中的作用提供动物模型；3周龄小鼠间质细胞中敲除Bicc1后1周，其肾脏和骨骼肌发生病理性改变。

目的:采用多组学方法探究多嘧啶束结合蛋白1（PTBP1）在肾透明细胞癌中的作用以及机制。方法:通过慢病毒载体导入CRISPR-Cas9方法构建PTBP1条件性敲除的人肾透明细胞癌细胞（786-O-PTBP1 KO），该细胞系购自中国典型培养物保藏中心。细胞计数试剂盒（CCK-8），迁移和侵袭实验（Transwell）评估PTBP1敲除对于肾透明细胞癌增殖、迁移和侵袭能力的影响。对照组786-O细胞（786-O-WT）和PTBP1条件性敲除786-O细胞（786-O-PTBP1 KO）分别进行全长转录组测序（RNA-Seq）和液相色谱-质谱联用分析（LC-MS/MS），检测肾透明细胞癌细胞在敲除PTBP1后出现的差异表达基因、转录本与蛋白；交联免疫共沉淀结合高通量测序（CLIP-Seq）检测剪切因子PTBP1在肾透明细胞癌中发挥作用的结合靶点RNA。通过Human Protein Atlas和Gene card数据库分析6个靶点的临床相关性。统计分析组间比较采用独立样本 t检验。 结果:KO组迁移细胞计数明显低于WT组（116比182， t＝14.73， P<0.01）；KO组侵袭细胞计数低于WT组（199比179， t＝4.34， P<0.01）；KO组细胞增殖倍数在24、48、72、96时均低于WT组细胞（0.438比0.493， t＝2.78， P<0.05；0.831比1.070， t＝10.86， P<0.01；1.354比1.804， t＝20.15， P<0.01；2.127比2.280， t＝8.91， P<0.01），差异有统计学意义。1 876个RNA-Seq差异基因与132个质谱分析差异基因的交集基因为78个，从中筛选出在352个CLIP-Seq结合峰中有显著结合的6个靶点基因RNA；临床数据库提示6个靶标中，N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）是PTBP1发挥促癌作用的目标靶点。 结论:PTBP1明显促进肾透明细胞癌的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与下游靶点之一的NSF及可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）介导的囊泡运输与自噬有关。