目的:检测胶质瘤组织中核不均一核糖核蛋白C(hnRNPC)表达，探讨hnRNPC对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法:分别采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测西南医科大学附属医院神经外科2017年1月至2018年12月经病理证实为胶质瘤组织标本hnRNPC mRNA和蛋白表达，采用小干扰RNA及慢病毒转染U87细胞，干扰U87细胞hnRNPC的表达并检测干扰效率，Transwell侵袭实验及划痕实验检测侵袭和迁移能力的改变，Western blot检测各组细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt蛋白表达；在稳定干扰hnRNPC的基础上使用胰岛素样生长因子(IGF)-1激活PI3K/Akt信号通路并检测U87细胞侵袭和迁移能力的变化。两组之间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析(SNK- q检验)。 结果:胶质瘤组织中hnRNPC表达为正常脑组织的(4.482±0.760)倍，差异有统计学意义( t＝－2.893， P<0.05)；稳定敲减hnRNPC后，Western blot检测实验组(sh-hnRNPC-1、sh-hnRNPC-2)较对照组(sh-Con)及空白组蛋白(Blank)表达分别下降(2.512±0.684)倍和(2.516±1.795)倍，差异有统计学意义( F＝81.256、70.863， P<0.05)，实验组(sh-hnRNPC)细胞迁移面积[(8.373±0.104)%]相对于对照组(sh-Con)细胞迁移面积[(16.610±0.440)%]和空白组(Blank)迁移面积[(17.867±0.570)%]明显减小，差异有统计学意义( F＝452.083， P<0.05)，实验组(sh-hnRNPC)穿过Transwell小室基底膜的细胞数目为(122.000±12.530)个，较对照组(sh-Con)细胞数目[(359.000±34.771)个]和空白组(Blank)细胞数目[(375.000±14.503)个]明显减少，差异有统计学意义( F＝114.944， P<0.05)，与瞬时敲减hnRNPC后结果一致。敲减hnRNPC后，各组细胞中PI3K、Akt表达无变化，差异无统计学意义( F＝0.388、2.590， P>0.05)，实验组(si-hnRNPC)p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显下调，分别降低了(2.060±1.046)倍和(3.087±0.514)倍，差异有统计学意义( F＝89.393、255.863， P<0.05)。稳定干扰hnRNPC，再加入IGF-1激活PI3K/Akt信号通路后，能逆转U87细胞侵袭和迁移能力。 结论:hnRNPC在胶质瘤组织的表达与胶质瘤病理级别呈正相关，胶质瘤病理级别越高，hnRNPC表达越高，提示hnRNPC可能参与胶质瘤的恶性发展；hnRNPC可通过PI3K/Akt信号通路调控胶质瘤细胞侵袭和迁移。

目的:采用细胞实验评价核转运蛋白β2 (Kapβ2)介导的核不均一性核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)核转位与七氟烷脑神经毒性的关系。方法:采用小鼠海马细胞系HT22细胞，以2×10 5/孔和1×10 6/孔的密度接种于共聚焦培养皿和六孔培养板，采用随机数字表法分为4组( n＝12)：携带绿色荧光蛋白(GFP)空载腺病毒转染的对照组(GFP-C组)、携带GFP空载腺病毒转染的七氟烷组(GFP-Sev组)、Kapβ2基因过表达腺病毒转染的对照组(Kapβ2-C组)和Kapβ2基因过表达腺病毒转染的七氟烷组(Kapβ2-Sev组)。细胞常规培养48 h后，转染携带GFP的空载腺病毒(GFP-C组和GFP-Sev组)和Kapβ2基因过表达的腺病毒(Kapβ2-C组和Kapβ2-Sev组)。转染48 h后GFP-C组和Kapβ2-C组继续常规培养48 h；GFP-Sev组和Kapβ2-Sev组采用3%七氟烷孵育3 h，随后常规培养48 h。采用Western blot法测定细胞Kapβ2、突触素(SYP)、突触后密度蛋白95(PSD95)、hnRNPA2/B1表达，并计算hnRNPA2/B1核质比。采用免疫荧光实验进行hnRNPA2/B1亚细胞定位。 结果:与GFP-C组比较，GFP-Sev组SYP、PSD95表达下调，hnRNPA2/B1核质比降低，细胞质hnRNPA2/B1表达上调，Kapβ2-C组Kapβ2表达上调( P<0.05)；与Kapβ2-C组比较，Kapβ2-Sev组SYP、PSD95表达下调，hnRNPA2/B1核质比降低，细胞质hnRNPA2/B1表达上调( P<0.05)；与GFP-Sev组比较，Kapβ2-Sev组Kapβ2、SYP、PSD95表达上调，hnRNPA2/B1核质比升高，细胞质hnRNPA2/B1表达下调( P<0.05)。 结论:Kapβ2介导的hnRNPA2/B1核转位可能是七氟烷脑神经毒性的内源性保护机制。

目的 检测妊娠期糖尿病患者血清中miR-873-5p、核内不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)的表达,分析二者与糖脂代谢和妊娠结局的关系.方法 回顾性选取2018年4月至2020年4月青岛市妇女儿童医院接收的80例妊娠期糖尿病患者为研究组,另选取年龄相仿、孕周相近的健康孕妇80名为对照组.采用qRT-PCR法检测血清miR-873-5p表达水平,酶联免疫吸附试验检测hnRNP K表达水平,同时检测并比较两组孕妇空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),分析孕妇血清miR-873-5p、hnRNP K与糖脂代谢指标和不良妊娠结局的相关性.ROC曲线分析血清miR-873-5p和hnRNP K联合对妊娠期糖尿病患者不良妊娠结局的评估效能.结果 研究组的空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、总胆固醇、LDL-C、FINS、HOMA-IR、血清miR-873-5p水平均高于对照组,血清HDL-C和hnRNP K水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).妊娠期糖尿病患者血清miR-873-5p表达与空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、LDL-C、FINS、HOMA-IR以及不良妊娠结局呈正相关(P＜0.05),与血清hnRNP K和HDL-C呈负相关(P＜0.05).血清hnRNP K与空腹血糖、HbA1c、甘油三酯、LDL-C、FINS、HOMA-IR以及不良妊娠结局呈负相关(P＜0.05),与HDL-C呈正相关(P＜0.05).血清miR-873-5p预测不良妊娠结局的曲线下面积(AUC)为0.765,灵敏度59.09％,特异度91.67％,血清hnRNP K预测的AUC为0.862,灵敏度93.18％,特异度77.78％,二者联合预测的AUC为0.882,灵敏度86.36％,特异度83.33％.结论 妊娠期糖尿病患者血清miR-873-5p水平升高,血清hnRNP K水平降低,二者与糖脂代谢及不良妊娠结局关系密切.

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)血管生成的影响,并阐明其潜在的分子机制.方法:采用生物信息学方法预测MALAT1、不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的结合位点.HBMECs进行OGD/R处理构建脑缺血细胞模型,分为对照组、OGD/R模型组、OGD/R+siNC组、OGD/R+沉默MALAT1(OGD/R+siMALAT1)组和OGD/R+siMALAT1+过表达VEGFA(OGD/R+siMALAT1+VEGFA)组.采用小干扰RNA(siRNA)沉默MALAT1的表达,采用pcDNA载体构建VEGFA过表达载体,将构建的siMALAT1和pcDNA VEGFA载体分别或同时转染至HBMECs中.利用管形成实验检测各组细胞血管形成能力,Western blotting法检测各组细胞中VEGFA蛋白表达水平.6周龄健康雄性C57BL/6 J小鼠20只,随机分为假手术组、大脑中动脉闭塞(MCAO)模型组、MCAO+NC空载体(MCAO+NC)组和MCAO+过表达MALAT1(MCAO+MATAL1)组,每组5只,除假手术组外,其余各组小鼠利用线栓法构建MCAO小鼠模型,MCAO+NC组和MCAO+MATAL1 组小鼠右脑室内分别注射NC空载体和MALAT1过表达载体.采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测各组小鼠脑梗死面积百分率,Western blotting法检测各组小鼠脑组织中VEGFA蛋白表达水平.结果:生物信息学预测,MALAT1与hnRNPK及hnRNPK与VEGFA均存在结合位点.管形成实验和Western blotting法检测,与对照组比较,OGD/R模型组细胞成管数明显增加(P<0.01),细胞中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与OGD/R模型组比较,OGD/R+siMALAT1组细胞成管数明显减少(P<0.01),细胞中VEGFA蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+siMALAT1 组比较,OGD/R+ siMALAT1+VEGFA组细胞成管数明显增加(P<0.01),细胞中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01).在MCAO模型小鼠实验中,TTC染色和Western blotting法检测,与假手术组比较,MCAO模型组小鼠脑梗死面积百分率和脑组织中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与MCAO模型组比较,MCAO+MALAT1组小鼠脑梗死面积百分率明显降低(P<0.01),脑组织中VEGFA蛋白表达水平明显升高(P<0.01).结论:LncRNA MALAT1可增强靶基因VEGFA的稳定性并上调其表达,进而促进缺血性脑卒中小鼠的脑血管生成,为缺血性脑卒中的治疗提供了新的思路.

目的 探讨hnRNPK与HPV16感染在宫颈上皮内瘤样变(CIN)中的作用及其交互效应.方法 选取2014年6月至2015年6月在山西省介休市建立的社区队列中经病理学确诊的正常宫颈(NC)女性67例和CIN患者137例(CIN Ⅰ患者69例、CINⅡ/Ⅲ患者68例)为研究对象.采用结构式问卷收集研究对象人口学资料及宫颈病变相关因素的基础上,采集宫颈脱落细胞和宫颈活检或手术组织,应用分子导流杂交法检测HPV16感染状况,并采用Western blot技术检测宫颈组织中hnRNPK蛋白表达水平.采用SPSS 23.0软件对资料进行整理分析,研究对象的人口学特征、相关因素、hnRNPK蛋白和HPV16感染在NC组、CIN Ⅰ和CINⅡ/Ⅲ组的差异通过x2检验、趋势x2检验、Kruskal-Wallis H检验进行比较;hnRNPK蛋白表达量的组间两两多重比较采用Bonferroni法;采用非条件logistic回归模型计算hnRNPK蛋白、HPV16感染与CIN的关联强度OR值及其95％CI,采用相加交互模型及交互效应指标评价hnRNP K蛋白和HPV16感染两因素在CIN中的交互效应.结果 CINⅡ/Ⅲ组HPV16感染率(41.2％)高于NC(10.4％)、CIN Ⅰ (14.5％),差异有统计学意义(P＜0.001),且随着CIN程度加重,HPV16的感染率呈上升趋势(趋势x2=18.512).hnRNPK蛋白表达量在NC组、CIN Ⅰ组和CINⅡ/Ⅲ组间差异有统计学意义(H=48.138,P＜0.001),且随着C1N程度加重呈上升趋势(趋势x2=21.765,P＜0.001).交互效应分析显示,hnRNPK蛋白高表达与HPV16感染在CINⅡ/Ⅲ组存在正相加交互作用(API=0.639,95％CI:0.083～1.196),在CIN Ⅰ组尚未发现存在类似交互作用.结论 hnRNP K蛋白高表达、HPV16感染均可能增加CIN的发生风险,且在高度CIN发生中存在正相加交互作用.

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释.蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制.本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1(Giardia lamblia up-frameshift 1,GlUPF1)、贾第虫RNA结合蛋白(Giardia lamblia HRP1,GlHRP1)、贾第虫核糖核酸外切酶(Giardia lamblia Ski7p,GlSki7p、Giardia lamblia XRN1,GlXRN1)之间的相互作用关系.结果表明,GlUPF1全长与GlHRP1、GlXRN1(1～500aa)、GlSki7p间均可发生相互作用.而且GlUPF1的CH结构域和C端结构域分别与GlHRP1、GlXRN1 (1～500 aa)、GlSki7p相互作用.说明GlUPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用.为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径:在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,GlUPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰,NMD途径激活,随后GlUPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物;GlUPF1进而招募下游贾第虫5'-3'核糖核酸降解酶GlXRN1、贾第虫3'-5'核糖核酸降解因子GlSki7p,最终降解靶标mRNA.

目的 探索沉默核内不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNP A2/B1)基因后对宫颈癌CaSki细胞的增殖、凋亡的影响及其相关作用机制.方法 建立稳定沉默hnRNP A2/B1的CaSki细胞株,分为未沉默hnRNP A2/B1的空白组(CaSki组)、转染阴性序列的阴性对照组(CaSki-NC组)、转染阳性hnRNP A2/B1干扰序列的实验组(CaSki-shRNA组).运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)对各组细胞hnRNP A2/B1的mRNA及蛋白表达水平进行验证,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,细胞克隆实验检测各组细胞克隆形成能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化.结果 与CaSki组、CaSki-NC相比较,CaSki-shRNA组细胞hnRNP A2/B1的mRNA及蛋白表达水平均明显减低,细胞的增殖能力在48 h降低,克隆形成能力下降,凋亡率增加,Bcl-2蛋白的表达减低,Bax表达升高(P<0.01),而CaSki组与CaSki-NC组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论 沉默hnRNP A2/B1基因后能抑制宫颈癌CaSki细胞的增殖能力,且可能通过Bcl-2/Bax影响宫颈癌CaSki细胞的凋亡.

目的 探讨核不均一核糖核蛋白L(hnRNP L)在肝癌(HCC)组织中的表达,并分析其与肝癌患者临床病理特征及巨噬细胞极化的关系.方法 通过免疫组织化学(IHC)检测90例HCC患者的癌组织和相对应癌旁组织中hnRNP L和巨噬细胞极化相关标志物(CD68、CD206和CD11c)的表达.qRT-PCR和Western blot法分析评估20对新鲜冰冻肝癌和癌旁组织中hnRNP L的表达水平.结果 免疫组化结果显示hnRNP L在肝癌组织中显著高表达(P =0.001),肝癌及癌旁组织的阳性表达率分别为77.7％ (72/90)和53.3％(48/90);qRT-PCR及Western blot结果显示,在转录和翻译水平,hnRNP L在肝癌组织的表达显著高于相对应癌旁组织(P＜0.001);hnRNP L在肝癌组织中的高表达与年龄、血管侵犯、Edmondson分级和BCLC分期显著相关(P=0.018、0.039、0.001、0.018);同时hnRNP L在肝癌组织的表达强度与CD68(总巨噬细胞标志物)和CD206(M2型巨噬细胞标志物)的浸润密度呈正向的一致性(κ =0.448、0.455,P＜0.001),与CD11c(M1型巨噬细胞标志物)浸润密度呈负向的一致性(κ=-0.394,P＜0.001).结论 hnRNP L在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,并与肝癌的恶性特征相关.同时hnRNP L的表达与巨噬细胞的极化相关,提示hnRNP L可能通过参与巨噬细胞极化调控肝癌的发生发展.

目的 研究白头翁皂苷B4对香烟烟雾(CS)诱导的慢性阻塞性肺病(COPD)及癌前病变的影响并探讨作用机制.方法 80只C57BL/6小鼠,雌雄各半,通过连续CS诱导法建立COPD小鼠模型.在造模第9周,按照体重将小鼠随机分为正常组、CS诱导组、白头翁皂苷B41.5,3和6 mg·kg-1组,阳性对照药地塞米松1.5 mg·kg-1组.熏烟前1 h给药,持续4周.造模及给药结束后,采用肺功能仪测定小鼠肺功能参数的变化;高通量蛋白芯片技术测定支气管肺泡灌洗液中炎症因子的含量;HE染色观察肺组织病理变化及上皮细胞增生情况;PCR法测定小鼠肺组织中转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)基因表达水平以及基质金属蛋白酶2(MMP2),MMP9,MMP12和MMP抑制剂(TIMP1)的表达;采用试剂盒测定小鼠血浆中髓过氧化物酶(MPO)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量;免疫组织化学法测定肺组织中抑癌基因(p53)、增殖细胞核抗原(ki67)以及核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)的表达;Western印迹法检测小鼠肺组织中DNA甲基转移酶(Dnmt1)、脆性组氨酸三联体(FHIT)、抑癌基因CDKN2A/P16蛋白表达水平.结果 白头翁皂苷B4能够显著降低吸气时间(Ti)、肺阻力(LR)(P<0.05),升高最大呼气流速(PEF)(P<0.05):白头翁皂苷B4可缓解炎症细胞浸润情况,并能够降低支气管肺泡灌洗液中炎症因子IL-2,IL-5,IL-18和IL-10含量(P<0.01),显著下调小鼠肺组织中炎症因子TGF-β,TNF-α和IL-1β基因表达水平(P<0.01),显著降低MMP2和MMP12基因表达,升高MMP9、TIMP1基因表达水平(P<0.01);白头翁皂苷B4给药组能够不同程度降低MDA含量及MPO活性,同时能够显著提升GSH-Px活性(P<0.05,P<0.01);免疫组织化学实验结果表明,白头翁皂苷B43和6 mg·kg-1组均能够显著上调P53蛋白表达(P<0.01);白头翁皂苷B4对Dnmt1和Cdkn2a/P16蛋白表达无影响,可显著下调FHIT蛋白表达水平(P<0.01).结论 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺功能具有一定程度改善作用,能够通过平衡小鼠肺组织中蛋白酶与抗蛋白酶表达,降低氧化应激水平,改善肺组织氧化应激进而起到保护作用,并有抑制癌前病变的作用趋势.