目的:使用preS1-tp融合蛋白作为新型的载体，介导针对乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区的小干扰RNA(siRNA)进入感染HBV的肝细胞，从而抑制HBV复制和共价闭合环状DNA的形成。方法:以慢病毒感染系统为基础，建立表达人牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽的HepG2.2.15细胞；针对HBV NLS区设计合成siRNA；表达纯化preS1-tp融合蛋白，检测其进入细胞和与DNA结合的能力；以preS1-tp融合蛋白为载体，介导NLS siRNA递送至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞中,观察其对HBV复制和共价闭合环状DNA水平的影响。多组间比较采用方差分析，计量资料用 t检验分析组间差异。 结果:成功构建HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞株并合成筛选出显著抑制HBV复制的HBV NLS siRNA。纯化并大量表达preS1-tp融合蛋白，以该融合蛋白为载体靶向输送HBV NLS siRNA，结果显示，融合蛋白可以有效靶向输送siRNA至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞，不仅可有效抑制细胞中HBV mRNA，HBsAg和HBeAg表达，还能显著降低HBV DNA和共价闭合环状DNA的水平。结论:preS1-tp融合蛋白利用preS1与肝细胞HBV受体结合，tp与核酸结合的双功能特点，将针对HBV NLS的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞，靶向阻断rcDNA转运入细胞核，使siRNA发挥抑制HBV复制和共价闭合环状DNA合成的作用，为HBV感染所致慢性乙型肝炎治疗提供新策略，为彻底清除体内HBV提供新的研究视角。

酪蛋白激酶(casein kinase,CK)作为一类普遍存在的Ser/Thr蛋白激酶,通过调节靶标蛋白的活性与稳定性,在植物整个生理过程及信号转导途径中发挥重要作用.基于同源序列比对,该研究对小桐子(Jatropha curcas)酪蛋白激酶基因家族进行鉴定与表达分析.结果表明,小桐子基因组中共鉴定到 7 个酪蛋白激酶 1 基因(CK1)、5 个植物特异性酪蛋白激酶 1 基因(PS-CK1)、3个酪蛋白激酶2α亚基基因(CK2-α)、2个酪蛋白激酶2β亚基基因(CK2-β),4个亚家族成员在氨基酸长度、等电点及外显子数目等都有其家族特异性.蛋白的氨基酸序列比对表明,小桐子酪蛋白激酶 1 都包含N端保守激酶结构域,同时其内部都鉴定到典型的激酶活性环基序、ATP结合核心基序、核定位信号肽.qRT-PCR表达分析表明,小桐子JcPS-CK1-5基因在叶片与根中都属于低温诱导基因,可能参与小桐子抗冷性过程.构建其原核表达载体 pET-32a-JcPS-CK1-5,并在BL21(DE3)中诱导表达,得到81.6 kD的条带,与理论融合蛋白的分子量一致.这可为小桐子CK基因的功能鉴定及逆境信号转导机制研究提供参考.

L-periaxin是外周神经系统特异表达的骨架蛋白之一,占外周神经系统髓鞘总蛋白质的16％,参与髓鞘形成和维护.埃兹蛋白(Ezrin)属于Ezrin-Radxin-Moesin (ERM)蛋白质家族,与细胞黏附、迁移、生存以及肿瘤的发生、发展相关.作者前期研究证实,L-periaxin与Ezrin通过“头对头,尾对尾”的模式相互结合.本文通过双分子荧光互补、免疫共沉淀、GST pull down、荧光共定位、海肾荧光素酶互补、荧光光谱以及分子对接等方法,揭示L-periaxin的核定位信号区(nuclear location signal,NLS)与蛋白质Ezrin的FERM(Ezrin Radixin Moesin)结构域的“头对头”相互结合,依赖L-periaxin第3段核定位信号序列NLS3与Ezrin的FERM结构域的F3亚结构域.本结果为进一步理解Ezrin在髓鞘化过程中的作用,以及阐明调节L-periaxin蛋白功能的信号通路奠定基础.

[目的]对人中心体蛋白Cep57(Centrosomal Protein 57)的理化性质、亲疏水性、跨膜区域、信号肽区域、二级结构、三级结构、蛋白质之间的相互作用、亚细胞定位进行预测分析.[方法]采用生物信息学方法,使用多种分析软件对Cep57进行预测分析.[结果]Cep57由500个氨基酸组成,等电点为9.35,在哺乳动物中较为保守;二级结构预测发现9个α螺旋和3个β折叠片层,三级结构预测结果的可靠性为100％,拉曼图分析表明预测结构稳定;亚细胞定位主要分布于细胞质及细胞核.[结论]人中心体蛋白Cep57是一个存在2种核定位序列的不稳定亲水蛋白,在细胞内分布范围广泛,参与维持细胞骨架的稳定及细胞周期的调控等生理活动.

目的 研究半胱氨酰白三烯受体1(CysLTR1)蛋白的羧基端核定位序列以及CYSLTR1刺激剂和拮抗剂对其核转位过程的影响.方法 首先构建CysLTR1野生型重组质粒pEGFP-C 1/CYSLTR1WT、含NLS序列的重组质粒pEGFP-C1/NLS及其突变型重组质粒pEGFP-C 1/CYSLTR1-dNLS和pEGFP-C 1/CYSLTR1-rNLS,转染人角质形成细胞后,通过激光共聚焦显微镜观察转染后24h、48h、72h时,以及分别加入CysLTR1刺激剂LTD4或其选择性拮抗剂MK571后CysLTR1的核转位情况.结果 pEGFP-C1/CYSLTR1WT和pEGFP-C 1/NLS在细胞核内的荧光强度增加与转染时间呈正相关,其细胞核内荧光强度占细胞内总荧光强度的比率与pEGFP-C1/CYSLTR1-dNLS和pEGFP-C 1/CYSLTR1-rNLS转染组比较差异有统计学意义(P均＜0.05);加入刺激剂LTD4后,也得到同样结果;加入选择性拮抗剂MK571后,pEGFP-C 1/CYSLTR1 WT在细胞核内的荧光强度无明显变化,其细胞核内荧光强度占细胞内总荧光强度的比率与pEGFP-C1/NLS、pEGFP-C1/CYSLTR1-dNLS和pEGFP-C 1/CYSLTR1-rNLS转染组比较差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 CysLTR1中的羧基端序列RKHSLSSVTYVPRKK是一个重要的核转位序列,在CysLTR1刺激剂LTI4可促进CysLTR1发生核转位,其选择性拮抗剂MK571可阻断其发生核转位.

目的 探讨新型基因编码钙指示剂(genetically-encoded calcium indicators, GeCIs)在药物反应性细胞核钙信号实时动态检测中的应用.方法 将常用的GeCI变体--GCaMP6s用核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)标记以用于细胞核钙的检测;同时在其C端与红色荧光蛋白tdTomato融合作为分子内的定量参照.将构建的质粒分别转染至HeLa细胞和U87MG细胞中,利用活细胞共聚焦显微成像技术对核钙信号的实时变化进行动态监测.结果 蕈青霉素(Paxilline)能够引起在40 min连续记录中核钙水平的持续增加,并且增加的动力学模式在不同的细胞系中差异存在统计学意义;同时在药物处理后细胞反应的筛选中显示,青蒿素可以引起细胞核钙浓度的明显改变,其变化的幅度与持续情况与蕈青霉素及过氧化氢的作用有所不同.此外,笔者还发现利用核钙的变化指标可以对细胞在接受应激性刺激后的异质性表现进行统计聚类分析.结论 在非兴奋细胞中,不同药物刺激可以引起细胞核钙离子浓度的升高.

目的 采用生物信息学方法 预测人源性胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)的分子结构和生物学功能.方法从美国生物信息中心获取人源性IGFBP3基因mRNA和蛋白氨基酸序列,利用ORF Finder在线工具分析IGFBP3蛋白开放阅读框,ProtParam预测IGFBP3蛋白的理化性质,Predict-Protein和SOPMA工具预测IGFBP3蛋白的二级结构,SWISS-MODEL预测IGFBP3蛋白的三级结构,SignalP4.1 Server和NLStradamus工具预测IGFBP3蛋白的信号肽和核定位信号,TMHMM软件包分析IGFBP3蛋白的跨膜区,BLAST工具预测IGFBP3蛋白的结构域,String软件预测与IGFBP3蛋白相互作用的蛋白,Gene Ontology Consortium预测IGFBP3蛋白的生物学功能.结果 IGFBP3属于不稳定亲水性分泌蛋白,二级结构主要为环状结构和螺旋结构,无跨膜区,包含5个保守结构域,能在细胞核中发挥生物学效应,与MMP2等多种蛋白作用紧密.IGFBP3可参与细胞凋亡、细胞增殖负调控、蛋白质磷酸化负调控、信号转导负调控、胰岛素样生长因子受体信号通路调控等生物学功能.结论 人源性IGFBP3是肿瘤发生的负性调控因子,可介导MMP2及其下游信号通路,参与调控肿瘤的发生、发展.

Akirin基因是新近发现的在果蝇NF-κB依赖的Imd信号通路调控中不可或缺的转录因子.在除果蝇以外的昆虫中,Akirin 基因是否参与Imd 通路的调控,亦或对NF-κB 依赖的Toll 通路也有调控作用还未有报道.本研究旨在初步研究德国小蠊Blattella germanica 中Akirin 基因的基本特征、在不同组织中的表达模式及注射法RNAi 实验对Akirin 基因沉默效果,以期为Akirin 基因功能的研究奠定基础.通过与已报道的其它昆虫的Akirin 基因进行同源比对,利用RACE (rapid amplification of cDNA ends)技术,成功从德国小蠊中克隆到1个Akirin 基因,该基因全长864 bp,开放阅读框(ORF)大小为543 bp,编码180个氨基酸.蛋白序列比对及进化树结果显示,Akirin 基因有非常保守的核定位信号序列,且与内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis 的亲缘关系最近,同源性为86％.荧光定量PCR 的结果表明Akirin 基因在德国小蠊检测的4个组织中均有表达,但表达水平有差异,在血淋巴的表达水平最高,其次为脂肪体.通过注射法RNAi 实验成功抑制了Akirin 基因的表达水平,并且RNAi 的效果随时间的延长而更强,在注射72 h 后,Akirin 基因mRNA 的表达水平下降了90％.上述研究为Akirin 基因的功能及德国小蠊防治研究提供了科学依据.

目的:探讨酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B (acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32B, ANP32B) 促进肿瘤发生、发展的分子机制, 为其可能作为治疗靶点提供理论依据.方法:利用免疫沉淀联合质谱技术寻找和验证ANP32B相互作用蛋白;免疫荧光技术检测ANP32B和核浆转运蛋白α6 (karyopherinα6, KPNA6) 在细胞内的定位;采用短发夹RNA (short hairpin RNA, sh RNA) 沉默KPNA6的表达;行GST-pulldown实验明确ANP32B与KPNA6直接结合及相互作用的区域.结果:通过免疫沉淀和质谱鉴定发现, ANP32B与KPNA6间存在相互作用, 两者的结合不依赖ANP32B N端1～161氨基酸序列.体外GST-pulldown实验证实, KPNA6与ANP32B间存在直接的相互作用, 且两者结合依赖ANP32B的核定位信号.利用sh RNA抑制KPNA6的表达后, 并不影响ANP32B的核内定位.结论:ANP32B通过核定位信号序列与KPNA6结合, 两者在细胞核中有明显的共定位, 而敲除KPNA6并不影响ANP32B的核内定位.

SP110是人核体蛋白SP110/140家族中的一员,包含了SP100区,SAND区,核定位序列(NLS)以及细胞核激素受体结合域(NRB)等多种功能结构区.其与能调节小鼠对结核病的先天免疫力的Ipr1基因的同源性达到了41％,因此被认为是影响人类肺结核发生,发展的新候选基因.受外界环境、不同人种以及种群等多种因素影响,SP110基因多个SNP位点存在变异.在不同的人种和人群中,其多态性与结核病易感性相关与否也存在着不同.本文将对SP110基因3个SNP位点rs3948464C/T、rs1135791、rs11679983A/G的研究进展进行综述.