目的:使用preS1-tp融合蛋白作为新型的载体，介导针对乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区的小干扰RNA(siRNA)进入感染HBV的肝细胞，从而抑制HBV复制和共价闭合环状DNA的形成。方法:以慢病毒感染系统为基础，建立表达人牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽的HepG2.2.15细胞；针对HBV NLS区设计合成siRNA；表达纯化preS1-tp融合蛋白，检测其进入细胞和与DNA结合的能力；以preS1-tp融合蛋白为载体，介导NLS siRNA递送至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞中,观察其对HBV复制和共价闭合环状DNA水平的影响。多组间比较采用方差分析，计量资料用 t检验分析组间差异。 结果:成功构建HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞株并合成筛选出显著抑制HBV复制的HBV NLS siRNA。纯化并大量表达preS1-tp融合蛋白，以该融合蛋白为载体靶向输送HBV NLS siRNA，结果显示，融合蛋白可以有效靶向输送siRNA至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞，不仅可有效抑制细胞中HBV mRNA，HBsAg和HBeAg表达，还能显著降低HBV DNA和共价闭合环状DNA的水平。结论:preS1-tp融合蛋白利用preS1与肝细胞HBV受体结合，tp与核酸结合的双功能特点，将针对HBV NLS的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞，靶向阻断rcDNA转运入细胞核，使siRNA发挥抑制HBV复制和共价闭合环状DNA合成的作用，为HBV感染所致慢性乙型肝炎治疗提供新策略，为彻底清除体内HBV提供新的研究视角。

目的:观察替诺福韦酯（TDF）抗病毒治疗对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8 +T细胞功能的影响，评估其与HBeAg血清学阴转的相关性。 方法:纳入2016年10月至2018年7月就诊的HLA-A02限制性HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者63例，予以TDF（300 mg/d）抗病毒治疗，分选基线和治疗48周时外周血CD8 +T细胞，流式细胞术检测外周血T细胞计数，酶联免疫斑点试验检测分泌穿孔素、颗粒酶B和γ干扰素（IFN-γ）的HBV特异性CD8 +T细胞频数，建立HBV特异性CD8 +T细胞与HepG2.2.15细胞直接接触和间接接触共培养系统，检测培养上清液中HBV DNA，通过检测乳酸脱氢酶水平计算靶细胞死亡率，酶联免疫吸附试验检测细胞因子表达，评估病毒特异性CD8 +T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能。2组计量资料比较采用 t检验或配对 t检验。 结果:TDF治疗48周时病毒学应答率为100%，生化学应答率为90.48%（57/63），HBeAg阴转率为25.40%（16/63）。外周血T细胞计数在TDF治疗48周时与基线及对照组比较差异均无统计学意义（ P > 0.05）。TDF治疗48周时，CHB患者分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的HBV特异性CD8 +T细胞频数较基线显著升高（ P < 0.001），HBeAg阴转的CHB患者病毒特异性CD8 +T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的频数亦显著高于HBeAg未阴转的患者（ P < 0.05）。在直接接触和间接接触培养系统中，TDF治疗48周时HBV特异性CD8 +T细胞均可诱导HepG2.2.15细胞培养上清液中HBV DNA显著下降（ P < 0.001），分泌IFN-γ和白细胞介素-2的水平显著升高（ P < 0.05），但仅在直接接触共培养系统中病毒特异性CD8 +T细胞诱导HepG2.2.15细胞死亡的比例升高（21.7%±6.18%比16.1%±4.15%， P < 0.001）。HBeAg阴转的CHB患者HBV特异性CD8 +T细胞较HBeAg未阴转患者诱导HBV DNA下降水平更显著（ P < 0.001）、IFN-γ分泌水平升高（ P < 0.05），但靶细胞死亡比例在HBeAg阴转和未阴转患者之间的差异无统计学意义（ P > 0.05）。 结论:TDF治疗过程中，伴随病毒载量下降，病毒特异性CD8 +T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能均显著增强，且与HBeAg阴转密切相关。

目的:阐释miR-340-5p对HBV复制的影响及其调控机制，并为HBV感染后的生物标志物和治疗用药提供新的策略。方法:在肝癌细胞HepG2.2.15中转染miR-340-5p的模拟物(340-mimic)和抑制剂(340-inhibitor)及其对应的阴性对照。通过ELISA检测上清中HBeAg和HBsAg的水平变化。同时收取细胞，提取RNA和壳体化DNA，并采用qRT-PCR分别检测HBV总RNA和pgRNA的水平及HBV DNA拷贝数的变化；分子克隆构建STAT3的过表达质粒pEF-flag-stat3，通过qRT-PCR和western blot对STAT3的mRNA和蛋白表达加以验证；此外，共转染miR-340-5p的模拟物和pEF-flag-stat3后通过northern blot，qPCR和ELISA对HBV的复制情况进行检测。结果:miR-340-5p过表达后，HBV转录生成总RNA和逆转录模板pgRNA的水平明显下降至对照组的45.89%、61.46% ( P＝0.001、 P＝0.003)；壳体化DNA的合成及HBeAg和HBsAg的分泌水平分别受到72.46%、18.27%、14.42%的抑制( P<0. 001、 P<0. 001、 P＝0.005)；干扰内源性miR-340-5p则与对照组相比分别增加44.02%、45.56%、22.66%、11.85%、14.04%( P＝0. 009、 P＝0. 01、 P＝0. 011、 P＝0.013、 P＝0.027)。相比之下在此基础上过表达信号转导和转录激活因子(STAT)3能够减弱被miR-340-5p抑制的HBV复制。进一步的实验结果也表明STAT3对HBV的复制有促进作用。 结论:miR-340-5p能够通过靶向作用于STAT3抑制其转录和翻译进而抑制HBV的复制。

目的:探讨乙型肝炎病毒（HBV）对抑制素（PHB）表达的影响及PHB在肝细胞癌（HCC）细胞增殖和存活中的作用。方法:应用实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹法检测13对HBV感染肝脏和正常肝脏及HepG2.2.15和HepG2细胞的PHB表达情况。收集7例慢性乙型肝炎患者抗病毒（替诺福韦酯）治疗前后的肝组织，采用RT-PCR技术和蛋白质印迹法检测PHB的表达。收集转染了Pcmv6-AC-GFP-PHB和对照载体的HepG2.2.15细胞。通过流式细胞仪分析DNA的含量。应用细胞增殖测定法检测每个细胞组的增殖水平。将转染了Pcmv6-AC-GFP-PHB的HepG2.2.15细胞和对照载体在无血清培养基中培养6 d。采用基于荧光激活细胞分选（FACS）的Annexin-V/碘化丙啶双重染色在指定的时间点检测细胞凋亡。组间比较采用Student t检验。 结果:与正常肝组织相比，HBV感染肝组织PHB表达下调（ P < 0.01）；与HepG2细胞相比，HepG2.2.15细胞PHB表达显著下降（ P < 0.01）。抗病毒（替诺福韦酯）治疗后的肝组织PHB表达水平较治疗前明显上调（ P < 0.01）。与对照载体相比，转染了Pcmv6-AC-GFP-PHB的HepG2.2.15细胞增殖速率明显低于对照载体，转染了Pcmv6-AC-GFP-PHB载体的HepG2.2.15细胞的凋亡率显著高于对照（ P < 0.01）。 结论:HBV下调PHB表达从而促进HCC细胞的增殖和存活。

目的:观察乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者中非特异性和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特异性Th9细胞、白细胞介素-9(IL-9)的变化及其对CD8 +T细胞功能的影响。 方法:纳入2018年1月至2019年1月在新乡医学院第一附属医院就诊的急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者12例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者58例、健康对照者20例，分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)和血浆，流式细胞术检测非特异性Th9细胞(CD3 +CD4 +IL-9 +)和HBcAg特异性Th9细胞，ELISA检测血浆IL-9水平。CHB患者接受富马酸替诺福韦二吡呋酯片(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)抗病毒治疗，观察抗病毒治疗48周时非特异性Th9细胞、HBcAg特异性Th9细胞和血浆IL-9的变化。分选12例HLA-A2限制性CHB患者的CD4 +CCR4 -CCR6 -CXCR3 -细胞(即Th9细胞)和CD8 +T细胞，与HepG2.2.15细胞共培养，同时在培养液中加入抗IL-9中和抗体，检测HepG2.2.15细胞死亡比例和IFN-γ、TNF-α水平。组间比较采用 t检验、单因素方差分析或SNK- q检验。 结果:非特异性Th9细胞和血浆IL-9水平在AHB患者、CHB患者和对照者之间的差异无统计学意义( P>0.05)，CHB患者中HBcAg特异性Th9细胞低于AHB患者[(2.49±0.61)% vs (3.19±0.62)%， P<0.001]，CHB患者中HBcAg特异性Th9细胞与HBV DNA呈显著负相关( r＝-0.385， P＝0.003)，但与丙氨酸转氨酶(ALT)无显著相关性( P>0.05)。TDF抗病毒治疗48周可显著升高CHB患者HBcAg特异性Th9细胞比例[(2.94±0.48)%， P<0.001]，但对非特异性Th9细胞和血浆IL-9水平无显著影响( P>0.05)。CHB患者HBcAg特异性Th9细胞的杀伤活性低，但可诱导CD8 +T细胞对HepG2.2.15细胞杀伤作用增强，主要表现为HepG2.2.15细胞死亡比例增加、IFN-γ和TNF-α水平升高，抗IL-9中和抗体可降低HBcAg特异性Th9细胞对CD8 +T细胞杀伤功能的增强作用( P<0.001)。 结论:慢性HBV感染可能抑制HBcAg特异性Th9细胞水平和功能，诱导感染慢性化。

目的:探究微小RNA-122(miR-122)抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染相关肝细胞癌生长的分子机制。方法:检测肝癌细胞HepG2、HepG2.2.15及肝细胞LO2中miR-122及N-myc下游调节基因3(NDRG3)的mRNA及蛋白表达。将HepG2.2.15细胞分为转染miR-122组(转染miR-122模拟物)、转染对照组(转染miR-122模拟物的对照物)和不作处理的对照组，检测各组细胞的miR-122、NDRG3 、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达变化，比较各组细胞的迁移、侵袭和增殖能力。结果:转染miR-122组的miR-122表达量为(2.32±0.05)，高于对照组的(0.48±0.09)，转染miR-122组NDRG3的mRNA及蛋白表达量分别为(0.45±0.15)、(0.43±0.08)，均小于对照组的(1.53±0.14)、(1.68±0.25)，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。转染miR-122组HBsAg、HBeAg及HBV-DNA表达量分别为(1.05±0.05)IU/ml、(0.69±0.09)NCU/ml、(0.45±0.07)Ig/ml，均小于对照组的(1.51±0.11)IU/ml、(1.32±0.15)NCU/ml、(1.00±0.12)Ig/ml，差异均有统计学意义( P<0.05)。转染miR-122组细胞迁移率(33.48±4.12)%、侵袭率(44.11±5.96)%均小于对照组的(91.22±11.45)%、(96.76±12.58)%，转染后48和72 h的细胞增殖率也降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。转染对照组与对照组的各指标比较差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:miR-122可能通过下调NDRG3表达而抑制HBV复制及抗原表达，进而阻断HBV感染的肝细胞癌的细胞增殖、侵袭及迁移。

目的:构建丁型肝炎病毒(HDV)感染的肝脏类器官系统，并探讨钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)受体抑制剂布乐韦肽对HDV复制的抑制作用。方法:将由诱导多能干细胞(iPSC)分化的肝细胞样细胞(HLC)接种于倒置胶体晶体聚乙二醇支架(ICC)，构建肝脏类器官系统。质粒转染人肝癌细胞(HuH7)后，收获细胞上清中的HDV颗粒，同时提取HepG2.2.15细胞上清液中的乙型肝炎病毒(HBV)颗粒，将HBV和HDV颗粒共同感染肝脏类器官，构建HDV感染的肝脏类器官，同时以未感染HDV的肝脏类器官作为阴性对照组。采用免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察肝脏类器官单元的结构及丁型肝炎抗原(HDAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的表达。蛋白质印迹法检测肝脏类器官中NTCP和HDAg的蛋白质水平。布乐韦肽Pre组为感染HDV前在肝脏类器官中加入布乐韦肽进行预处理，布乐韦肽Post组为感染24 h后加入布乐韦肽，IFN-α组为感染24 h后加入α干扰素，并设未经药物处理的空白对照组，比较4组的HDV复制情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测iPSC分化过程中Nanog同源框(NANOG)、性别决定区Y框(SOX)2、SOX17、叉头框蛋白A2(FOXA2)、肝细胞核因子4α(HNF-4α)、白蛋白、甲胎蛋白、NTCP的mRNA相对表达量，以及药物干预后4组HDV mRNA表达量。统计学分析采用两独立样本 t检验。 结果:iPSC分化为HLC的21 d内，NANOG的mRNA表达量逐渐下降，SOX17、FOXA2的表达量先升后降，HNF-4α、白蛋白、甲胎蛋白、NTCP的表达量逐渐升高。iPSC中NTCP的蛋白质水平为0.118±0.003，低于HLC的1.315±0.073，差异有统计学意义( t＝11.92, P<0.001)。HDV感染后肝脏类器官中HDAg的蛋白质水平高于未感染HDV的阴性对照组(1.284±0.128比0.157±0.040)，差异有统计学意义( t＝23.27, P<0.001)。感染第14天激光共聚焦显微镜下观察到三维球体结构，HDAg与HBsAg高表达。用药干预后第3天，分别与空白对照组(1.000±0.077)比较，IFN-α组(0.453±0.028)和布乐韦肽Pre组(0.136±0.012)的HDV mRNA相对表达量均下降，差异均有统计学意义( t＝19.95、33.15，均 P<0.001)。而布乐韦肽Post组(0.968±0.069)与空白对照组的HDV mRNA相对表达量差异无统计学意义( t＝0.94， P>0.05)。 结论:iPSC衍生的HLC与ICC构建的肝脏类器官能模拟人体肝脏功能，并成功感染HDV颗粒。经布乐韦肽早期阻断能有效降低HDV感染肝脏类器官系统中病毒的复制水平。

目的:研究神经前体细胞表达发育调控样基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like， NEDD4 L)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制的影响及其可能的分子机制。 方法:采用Lipofectamine2000分别将靶向 NEDD4 L的小干扰RNA、 NEDD4 L的过表达质粒(pcDNA3.1- NEDD4 L-HA)、HBV复制质粒(pGEM-HBV1.3)和poly(dAT：dAT)瞬时转染至HepG2细胞，并以可稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测 NEDD4 L、α干扰素、β干扰素、干扰素刺激基因56(interferon-stimulated gene 56， ISG56)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, MxA)、寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase， OAS)等的mRNA水平，以及HBV DNA和3.5 kb HBV RNA的表达水平；采用蛋白质印迹法验证NEDD4L沉默或过表达效果，并检测相关信号分子的蛋白质水平；采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中β干扰素产量。统计学方法采用 t检验。 结果:HepG2.2.15细胞中的NEDD4L mRNA和蛋白质水平分别为10.53±0.47和4.17±0.43，分别高于HepG2细胞中的1.00±0.05和1.26±0.25，差异均有统计学意义( t＝3.27， P＝0.008； t＝1.68， P＝0.030)。在敲减 NEDD4 L基因表达的细胞中，上清液HBV DNA表达水平为0.32±0.09，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.93， P＝0.020)；3.5 kb HBV RNA表达水平为0.49±0.11，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.68， P＝0.040)。与对照组相比， NEDD4 L敲减组的β干扰素、 ISG56、 MxA和 OAS的mRNA相对表达水平均上升，差异均有统计学意义( t＝4.66、9.38、7.29、7.01，均 P<0.01)。 NEDD4 L敲减组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)刺激时分别为(776.41±115.49) ng/L和(961.21±130.19) ng/L，分别高于对照组的(320.15±56.05) ng/L和(440.17±67.82) ng/L，差异均有统计学意义( t＝2.43， P＝0.020； t＝2.85， P＝0.030)； NEDD4 L过表达组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和VSV刺激时分别为(156.18±26.47) ng/L和(176.67±34.51) ng/L，分别低于对照组的(320.38±49.39) ng/L和(440.59±68.83) ng/L，差异均有统计学意义( t＝－2.03， P＝0.040； t＝－1.93， P＝0.030)。HBV复制下调了β干扰素上游黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)的蛋白质水平，而该下调作用在敲减 NEDD4 L的细胞中并不明显。 结论:HBV复制能通过促进细胞NEDD4L的表达，下调MDA5而抑制β干扰素的产生，进而辅助HBV的固有免疫逃逸。

目的:以诱导多能干细胞(iPSC)和倒置胶体晶体聚乙二醇支架(ICC)为基础构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝脏类器官系统，并验证核苷类药物的抗病毒作用。方法:将iPSC分化诱导成肝细胞样细胞(HLC)，并接种至ICC中建立肝脏类器官系统。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Nanog同源框(NANOG)、性别决定区Y框(SOX)2、SOX17、叉头框蛋白A2(FOXA2)、甲胎蛋白、白蛋白的mRNA相对表达水平；应用激光共聚焦显微镜对类器官三维结构进行摄片；采用蛋白质印迹法和免疫荧光分析HLC中钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)表达水平。HepG2.2.15细胞提取HBV病毒颗粒感染肝脏类器官，RT-qPCR法检测细胞内HBV前基因组RNA(pgRNA)相对表达量；激光共聚焦显微镜下观察细胞质中乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)表达。分别以0.5 μmol/L恩替卡韦、0.5 μmol/L拉米夫定干预HBV感染细胞，采用RT-qPCR法检测感染与未感染细胞内HBV pgRNA相对表达量。统计学分析采用独立样本 t检验和单因素方差分析。 结果:iPSC分化21 d内，干细胞标志物NANOG、SOX2 mRNA表达水平降低( F＝158.90、8.31， P<0.001， P＝0.002)，内胚层SOX17、FOXA2 mRNA表达水平先升高后降低( F＝37.23、82.57，均 P<0.001)；分化后期，肝细胞中甲胎蛋白、白蛋白mRNA表达水平升高( F＝4.65、34.64， P＝0.012， P<0.001)，差异均有统计学意义。蛋白质印迹法和荧光显微镜下显示分化后细胞中NTCP高表达，其蛋白质相对表达水平为0.803±0.099，激光共聚焦显微镜显示分化后肝细胞表达白蛋白，在ICC中呈现三维球体结构。HBV pgRNA表达和HBsAg、HBcAg的免疫染色证实HBV成功感染肝脏类器官系统。核苷类药物作用类器官系统3 d后，恩替卡韦组(0.665±0.220)和拉米夫定组(0.503±0.117)的HBV pgRNA水平较未感染细胞(3.347±0.454)明显下降，差异均有统计学意义( t＝10.53、12.72，均 P<0.001)。 结论:iPSC分化后表现出肝脏特异性基因白蛋白和NTCP，以iPSC和ICC构建的肝脏类器官系统具有人体肝脏功能，HBV能感染该系统，恩替卡韦、拉米夫定能有效抑制肝细胞中HBV复制。

目的:在乙型肝炎病毒(HBV)阳性肝癌鸡胚移植模型中,探讨一氧化氮供体JS-K对肿瘤细胞生长的影响.方法:将HBV阳性肝癌细胞HepG2.2.15接种于9日龄受精鸡胚中,按照处理方式不同分为5组:阴性对照组,JS-K低、中、高剂量组(1、5、10 μg/个),索拉非尼(Sora)组(400μg/个),每组各3只.2 d后按分组给药,给药采用直接滴加于移植瘤上的方式,1次/d,连续8 d.实验结束后取出鸡胚移植瘤,观察各组移植瘤大小,拍照并称重,采用HE染色法观察各组JS-K对肿瘤细胞的影响;采用免疫印迹法检测肿瘤组织中迁移相关蛋白Vimentin及N-Cadherin的表达情况.结果:与对照组相比,不同剂量JS-K作用后,鸡胚移植瘤体积均明显减小,其中JS-K高剂量组肿瘤体积最小(P＜0.05);HE染色可见JS-K作用后瘤细胞数量明显减少;JS-K低剂量组鸡胚移植瘤波形蛋白Vimentin表达水平高于其他组,N-cadherin表达水平低于其他组(P＜0.05).结论:JS-K对HBV阳性肝癌鸡胚移植瘤具有抑瘤作用,该效应可能与抑制鸡胚移植瘤细胞迁移有关.