目的:利用携带腺苷三磷酸结合盒转运子A3( ABCA3)复合杂合突变的新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)患儿的外周血单核细胞(PBMCs)，建立符合研究需求的诱导多能干细胞(iPSCs)细胞系。 方法:细胞实验研究。采集患儿的外周静脉血并分离出PBMCs，体外培养，用携带重编程因子的非整合性仙台病毒载体转染PBMCs，对所产生的iPSCs细胞系进行染色体核型分析。采用免疫荧光技术、流式细胞术检测干细胞多能性标志物、验证其分化潜能，采用Sanger测序对基因突变进行分析，另外还行短串联重复序列(STR)位点分析，聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳法检测病毒残留。结果:对建立的iPSCs细胞系行核型分析显示为正常的二倍体46，XY核型，免疫荧光技术显示干细胞多能性标志物OCT4、SSEA4、Nanog及Sox2染色呈阳性。流式细胞术检测干细胞多能性标志物，显示TRA-1-60、SSEA-4和OCT4的表达。诱导向三胚层分化后用免疫荧光技术对外胚层(PAX-6)、中胚层(Brachyury)和内胚层(甲胎蛋白)标志物进行免疫荧光染色，结果显示均为阳性。Sanger测序显示c.3997_3998del及c.3137C>T复合杂合突变。STR位点分析结果显示其来源于患儿PBMCs，PCR和琼脂糖凝胶电泳法未检测到仙台病毒残留。结论:本研究用 ABCA3复合杂合突变患儿的PBMCs建立了iPSCs细胞系，为 ABCA3基因突变所致的NRDS发病机制的研究、治疗药物筛选及细胞治疗奠定了基础。

目的:分析非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）模型大鼠视网膜蛋白质表达变化。方法:Sprague-Dawley大鼠20只，随机分为NAION动物（rNAION）模型组、单纯激光照射组、单纯光敏剂孟加拉玫瑰红（RB）组（单纯光敏剂RB组）、正常对照组，每组各为5只，均以右眼为实验眼。采用光动力疗法建立rNAION模型。建模后3 d分离各组大鼠视网膜。采用酶切法进行样本制备；非数据依赖方式采集质谱数据；SWATH定量质谱技术对数据进行定量分析，筛选差异蛋白并进行功能及相关通路分析。结果:rNAION模型组共筛选出差异蛋白184个（表达倍数大于1.5且 P<0.05 ）。其中，上调蛋白99个，下调蛋白85个。胶质纤维酸性蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白4、层粘连蛋白1、14-3-3γ蛋白YWHAG等蛋白表达增加；富含亮氨酸胶质瘤失活蛋白1、分泌载体膜蛋白5及网格蛋白外套蛋白AP180表达降低。差异蛋白主要参与神经生长、能量代谢、囊泡介导的转运、突触可塑性调节、凋亡及炎症反应等生物学进程。通路富集分析结果显示，差异蛋白主要参与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （PI3K/Akt）信号通路及补体和凝血酶联反应等信号通路。 结论:NAION的发生可能通过改变能量代谢、神经生长、突触囊泡的运输及PI3K/Akt信号通路等蛋白表达，共同调控神经细胞再生及凋亡。

旨在探讨茱萸丸对动脉粥样硬化(AS)的影响及可能的作用机制.采用高脂饲料喂养诱导小鼠AS模型,造模周期为12周.造模成功的50只载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠按照随机数字表法分为5组,即模型组,茱萸丸低、中、高剂量组,阿托伐他汀钙组,每组10只;C57BL/6J小鼠10只作为空白组.空白组及模型组给予等体积无菌蒸馏水灌胃,茱萸丸低、中、高剂量组给予130.54、261.08、522.16 mg·kg-1灌胃,阿托伐他汀钙组给予10.40 mg·kg-1灌胃,每日1次,共12周.给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠主动脉、肝脏、附睾脂肪的病理学变化,并计算主动脉斑块面积占比、附睾脂肪面积、非酒精性脂肪肝活动性积分(NAS);油红O染色、Masson染色观察主动脉脂质及胶原纤维沉积,并计算主动脉红染脂质面积占比、主动脉胶原沉积面积占比;比色法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、铁离子水平;免疫荧光法检测主动脉环氧合酶2(COX2)、铁蛋白重链1(FTH1)、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白水平;免疫组化法检测主动脉肿瘤蛋白53(p53)水平;蛋白免疫印迹法检测主动脉p53、SLC7A11蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测小鼠主动脉p53、SLC7A11、GPX4、FTH1、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)mRNA表达水平.结果显示,与空白组比较,模型组小鼠主动脉斑块面积明显扩大,胶原纤维沉积增加,肝脏脂质沉积增加,脂滴变多,附睾脂肪细胞体积扩大;血清中铁离子、MDA含量升高,SOD、GSH-Px水平降低;p53、COX2蛋白表达升高;主动脉FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达降低;PTGS2、NOX1 mRNA表达升高.与模型组比较,茱萸丸低、中、高剂量组及阿托伐他汀钙组小鼠主动脉斑块面积明显缩小,胶原沉积减少,肝脏脂质沉积减少,脂滴变少,附睾脂肪细胞体积缩小;血清中铁离子、MDA含量降低,SOD、GSH-Px水平升高;p53、COX2蛋白表达降低;主动脉FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达升高;PTGS2、NOX1 mRNA表达降低.综上所述,茱萸丸对小鼠AS主动脉斑块具有较好的治疗作用,其机制可能与调控p53/SLC7A11信号通路介导的氧化损伤及抑制细胞铁死亡有关.

为深入研究黄颡鱼Tachysurus fulvidraco Cu稳态调控机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得了810和192 bp的ccs(Pfccs)和cox17(Pfcox17)基因编码序列,并成功构建了pET32a(+)-Pfccs和pET32a(+)-Pfcox17重组表达载体;转化重组质粒到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达,发现PfCCS蛋白主要在沉淀中表达,PfCOX17蛋白主要在上清中表达;分别采用包涵体和亲和层析纯化的方法得到了纯度较高的重组PfCCS和PfCOX17蛋白;以纯化得到的PfCCS和PfCOX17蛋白免疫Balb/C小鼠3次,制备多克隆抗体.通过Western Blot鉴定了PfCCS和PfCOX17抗血清可以分别特异性识别重组PfCCS和PfCOX17蛋白,也可以分别特异性识别黄颡鱼内源性CCS和COX17蛋白.通过Western Blot对黄颡鱼CCS和COX17蛋白在鳃、心脏和肝脏中的分布情况进行检测,发现黄颡鱼CCS和COX17蛋白在肝脏中具有较高的表达水平,CCS蛋白在鳃中的表达水平最低,而COX17蛋白在鳃和心脏中的表达水平都很低.综上所述,研究成功制备了黄颡鱼CCS和COX17蛋白的多克隆抗体,为深入研究CCS和COX17蛋白在Cu转运中的作用及黄颡鱼Cu稳态调控机制奠定基础.

胰腺癌预后较差,化疗在胰腺癌的治疗中发挥重要作用.以吉西他滨的主的化疗方案是胰腺癌化疗的标准方案.而吉西他滨耐药仍然是延长患者总生存(overall survival,OS)和无病生存期(disease free survival,DFS)的重要阻碍.目前研究表明,在多种吉西他滨耐药细胞系中RRM1和hENT1有不同程度表达.而目前通过对RRM1、hENT1等相关基因的表达预测吉西他滨的化疗效果的研究仍处于初级阶段,有待更进一步的研究.本文对RRM1、hENT1的表达与吉西他滨化疗的耐药性及预后新进展作一综述.

目的 探讨低剂量吉西他滨化疗在溶质载体家族1号基因(SLC29A1) T1288A突变型胰腺癌患者中的疗效及不良反应.方法 以收治的SLC29A1基因T1288A突变型中晚期胰腺癌患者共72例,随机归入实验组(低剂量吉西他滨,600 mg/m2)36例和对照组(标准剂量吉西他滨,1000mg/m2)36例,观察评价化疗疗效及不良反应.结果 疗效比较中,实验组与对照组各项指标比较差异均无统计学意义.不良反应比较中,实验组白细胞减少、血小板减少、红细胞减少、恶心呕吐、肝损害、腹泻、皮疹和瘙痒、流感样症状发生率分别为3例(8.3％)、3例(8.3％)、4例(11.1％)、6例(16.7％)、2例(5.6％)、3例(8.3％)、1例(2.8％)、1例(2.8％);对照组为12例(33.3％)、15例(41.7％)、13例(36.1％)、20例(55.6％)、2例(5.6％)、4例(11.1％),1例(2.8％)、1例(2.8％),不良反应中白细胞减少(P=0.009)、血小板减少(P=0.001)、红细胞减少(P=0.013)、恶心呕吐(P=0.001),差异有统计学意义.通过随访观察两组6个月和1年生存期比较差异无统计学意义.结论 对于SLC29A1基因T1288A突变型胰腺癌患者,在一定范围内给予低剂量吉西他滨化疗,在不降低化疗疗效同时可有效减少化疗不良反应.

目的 探讨胰腺癌组织中RRM1、hENT1的表达及其与吉西他滨化疗敏感性的关系.方法 对12例胰腺癌患者在化疗前以免疫组化染色法检测核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)、核苷转运载体(hENT1)表达,后行吉西他滨化疗,3个月后评价疗效.结果 RRM1阴性患者的RR显著优于RRM1阳性者,hENT1阳性患者的RR显著优于阴性者(P＜0.05).结论 胰腺癌患者肿瘤组织中RRM1、hENT1表达可能成为预测吉西他滨化疗效果的指标,为选择最佳化疗方案提供理论依据.

为探究草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒VP6和VP38蛋白的生物学功能,利用酵母双杂交Gal4系统分别筛选了能与GCRV104毒株编码的VP6和VP38相互作用的宿主蛋白.利用RT-PCR从感染GCRV104的草鱼肾脏细胞中扩增GCRV104 s8和s10基因组片段的编码基因后,通过酶切与连接分别克隆至载体pGBKT7中,构建诱饵质粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38.对这些重组质粒进行细胞毒性和自激活检测后,分别以VP6和VP38为诱饵在草鱼酵母文库中筛选与其相互作用的宿主蛋白,对筛选得到的阳性酵母菌落进行序列分析.结果表明,两个诱饵质粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38均无自激活作用;诱饵质粒pGBKT7-VP6筛选到7株阳性克隆,分别编码β肌动蛋白、augmin样复合体亚基2、甘露糖苷酶α2b1亚基、程序性细胞死亡蛋白6、真核翻译延长因子1γ和一个未知功能蛋白;诱饵质粒pGBKT7-VP38筛选到4株阳性克隆,分别编码剪切与多聚腺苷酸化特异性因子5、高迁移率组蛋白核小体结合结构域2、葡萄糖转运体X和蛋白酶体亚基β7.结果为进一步探究GCRV104毒株编码的VP6、VP38与宿主蛋白及其涉及的信号通路的相互作用奠定了基础.

目的 构建肌浆网-内质网钙离子转运ATP酶(SERCA)基因的干扰慢病毒表达载体,建立稳定转染的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC 12)细胞系.方法 人工设计、合成针对SERCA基因干扰序列,退火后连接到PGLV3干扰载体上,与pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染PC 12细胞,建立稳定细胞株;应用RT-PCR和Western blot技术检测PC 12稳定细胞中SERCA基因和蛋白表达情况,并与对照组进行比较.结果 成功构建了针对SERCA基因的RNAi慢病毒表达载体,病毒滴度为3×10s U·mL-1;建立稳定转染的PC 12细胞株.有效干扰验证显示,shSERCA能明显降低SERCA的mRNA及蛋白水平(P＜0.01).结论 成功构建SERCA基因的shSERCA慢病毒表达载体,建立稳定干扰SERCA表达的PC 12细胞株.

目的 构建人肾脏近曲小管阴离子转运体1(human organic anion transporter 1,hOAT1)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒,获得稳定表达pEGFP-hOAT1的HEK-293细胞系.方法 构建EGFP与hOAT1的融合基因表达载体pEGFP-hOAT1,并利用FuGENE 6转染试剂将其转染至HEK293细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,经G418抗性筛选获得稳定转染细胞株.用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术,检测稳定转染细胞及正常细胞hOAT1 mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的对氨基马尿酸摄取能力,以及丙磺舒对hOAT1的抑制作用.结果 使用该文的方法,细胞转染率可达90％.RT-PCR、qRT-PCR、Western blot,以及对氨基马尿酸摄取、丙磺舒抑制实验结果显示,相对于正常组,转染细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光,其hOAT1表达均呈阳性(P<0.01);稳定转染细胞的对氨基马尿酸摄取能力明显升高(P<0.05),且丙磺舒对hOAT1有明显的抑制作用(P<0.05).结论 高效快速地建立了稳定高表达hOAT1的HEK293细胞系,为核苷类膦酸类似物这类药物引起的临床剂量依赖性肾毒性的机制研究奠定了模型基础,也为体外研究hOAT1底物或抑制剂的筛选提供了一个便利的工具.