目的:基于多重聚合酶链式反应（PCR）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）联用的高通量检测技术，构建不同菌种的特征性单核苷酸多态性图谱以建立血流感染病原菌快速、准确、高灵敏的诊断方法。方法:选取血流感染常见的大肠埃希菌等7种病原菌作为检测对象，优化多重PCR条件，采用MALDI-TOF MS检测各目标菌特征峰，建立多重PCR联合质谱检测体系；分别设计普通引物对及中部同序引物对，分析引物二聚体的形成情况；采用模拟的细菌感染血液样本，测定上述建立体系的特异度及灵敏度；收集2020年6—9月解放军总医院检验科疑似菌血症患者血液样本150份，并将上述体系的鉴定结果与临床应用的传统鉴定方法结果使用χ2检验进行比较。结果:本研究设计的中部同序引物对的引物二聚体循环阈值（Ct）值在38以上，比普通引物对延迟出现6~10个循环；建立的联合质谱检测体系可同时检测分为两组的7种细菌，目标菌均可检测到特异的产物峰，除目标菌外的临床菌株只有引物峰，所有图谱无非特异的杂峰；大肠埃希菌的灵敏度可以达到50 CFU/ml，其余各菌的检测限为100 CFU/ml；对150例患者的血液样本进行检测，传统方法鉴定出阳性46例，阳性检出率为30.67%（46/150），包括2例混合感染，联合质谱方法鉴定出阳性48例，阳性检出率为32.0%（48/150），包括3例混合感染；阴性符合率为100%（101/101），核酸质谱敏感度为97.82%（45/46），特异度为97.11%（101/104），一致性检验Kappa=0.938（ P=0.625），2种方法检测一致性良好。 结论:所建立的检测体系不仅能快速、准确地鉴定引起血流感染的7种常见病原菌，有效缩短传统培养鉴定所需时间，还可检测多重细菌混合感染，弥补混合感染漏检可能。该方法也可用于其他病原菌的鉴定。

质谱技术是一种基于质谱仪设备检测物质分子量的谱学技术方法。质谱类型众多、功能各异，在各个学科领域中广泛用于科学研究与应用技术开发。近年来，质谱技术在核酸检测分析中显现出巨大的潜力，尤其是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的核酸检测分析技术，因其快速、高通量、准确等特性而成为研究热点。采用质谱技术进行核酸研究，突出表现在对单核苷酸多态性、基因突变、DNA甲基化及DNA拷贝数变异的检测分析。本文对质谱技术在核酸检测中的研究与应用进行阐述，以期为基于质谱的新型核酸检测技术的开发与应用提供参考。

目的:联合聚合酶链反应与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术，构建检测5种临床常见念珠菌血症病原菌的高通量检测方法。方法:方法学建立。以白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌为目标菌株，以内转录间隔区为靶基因，设计特异的单碱基延伸引物，在同一反应体系内进行单碱基延伸反应，用MALDI-TOF MS检测各目的菌特征峰；使用模拟血流感染样本验证上述构建的检测体系敏感度、特异度；前瞻性收集2021年10月至2022年9月解放军总医院第一医学中心检验科108例疑似或确诊念珠菌血症患者血液样本并检测；将核酸质谱检测结果与金标准血培养方法进行比较。结果:用所建立的核酸质谱检测体系同时检测5种临床常见念珠菌，各菌种均可产生特异的产物峰且各菌种之间不存在相互干扰。白色念珠菌的最低检测限可达100 CFU/ml，近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌的最低检测限可达10 CFU/ml。对108份血液样本进行检测，核酸质谱的敏感度为94.74%（36/38），特异度为97.14%（68/70），阳性预测值为92.31%（36/39），阴性预测值为98.55%（68/69），配对四格表的χ 2检验显示2种方法无显著差异（ P>0.05），Kappa一致性检验显示2种方法一致性良好（ Kappa=0.9， P<0.05）。 结论:成功构建了适用临床念珠菌检测的核酸质谱检测体系，方法验证结果与临床血培养具有一致性。

目的:评估核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术在痰抗酸染色涂片阴性非结核分枝杆菌（nontuberculous Mycobacteria，NTM）肺病患者中的诊断价值。方法:回顾性收集2022年7月至2023年11月在山东大学附属公共卫生临床中心住院的痰抗酸染色涂片阴性疑似NTM肺病123例患者临床资料。对支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）标本进行MALDI-TOF MS技术检测和MGIT 960培养。评估MALDI-TOF MS技术在痰抗酸染色涂片阴性NTM肺病中的诊断效能。采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。采用MedCalc统计软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算曲线下面积（area under curve，AUC）。结果:123例痰抗酸染色涂片阴性疑似NTM肺病患者中，最终确诊NTM肺病 66例。MALDI-TOF MS检测NTM菌种和耐药的时间为8~24 h，共分离72株NTM，居首位的是鸟分枝杆菌复合群34株（47.22%），其次是脓肿分枝杆菌复合群13株（18.06%），有6例患者检测到大环内酯类耐药，未检测到氨基糖苷类药物耐药。BALF MGIT 960培养和鉴定时间为9~45 d，NTM分型和药敏检测时间为7~15 d，共分离28株NTM，有1例患者检测到大环内酯类耐药。以确诊诊断为金标准，MALDI-TOF MS技术检测痰抗酸染色涂片阴性NTM肺病的敏感度、阴性预测值和符合率均高于MGIT 960培养，差异均有统计学意义（84.85%比42.42%，81.13%比56.32%，80.49%比62.60%， χ2=25.667、8.998和9.664， P<0.05或<0.01）。MALDI-TOF MS技术的ROC AUC为0.801，高于MGIT 960培养的AUC（0.642）。MALDI-TOF MS技术的诊断效能高于MGIT 960培养（ Z=3.300， P=0.001）。 结论:相比MGIT 960培养，MALDI-TOF MS技术在诊断痰抗酸染色涂片阴性NTM肺病患者的诊断效能更高，同时能鉴定NTM菌种及耐药情况，且时间更短。

目的 探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在疑似肺结核(PTB)诊断中的应用价值及其阳性结果的影响因素,以期为临床治疗提供参考.方法 选取甘肃省第二人民医院(西北民族大学附属医院)2022年8月-2023年3月收治的疑似PTB患者77例为研究对象.所有患者肺泡灌洗液(BALF)均接受MALDI-TOF MS检测和结核分枝杆菌(MTB)培养.根据MTB培养结果,对核酸MALDI-TOF MS检测进行诊断效能分析,并探讨核酸MALDI-TOF MS检测阳性的影响因素.结果 核酸MALDI-TOF MS检测结果显示,MTB阳性共37例(48.1％,37/77),40例阴性(51.9％,40/77).以培养结果为金标准,核酸MALDI-TOF MS的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和准确度分别为90.9％、84.1％、81.1％、92.5％和87.0％,采用Kappa检验法评价核酸MALDI-TOF MS检测和MTB培养法的一致性,结果显示Kappa值为0.739(P＜0.05).2组患者在是否有糖尿病、身体质量指数(BMI)及降钙素原(PCT)方面比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).多因素Logistic回归分析结果显示:有糖尿病和PCT异常为核酸MALDI-TOF MS阳性的独立危险因素(P＜0.05).结论 核酸MALDI-TOF MS检测对PTB的早期诊断具有重要价值,可为患者的规范用药提供更好的指导,即为患者的治疗制定更为精准、有效的治疗方案,从而提高治疗效果、改善患者生活质量.

食品中最为常见的产毒霉菌主要为曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属、木霉属、头孢霉属和单端孢霉属等霉菌,其产生的霉菌毒素对人类和动物健康构成严重危害,同时也造成巨大农业经济损失.直接针对产毒霉菌而不是霉菌毒素的检测可以更为前瞻性减少产毒霉菌对人和动物的危害.本文综述了目前直接针对产毒霉菌的快速检测方法,包括免疫学方法、核酸检测方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测方法,以期能为产毒霉菌更为快速、准确检测方法的开发提供参考依据.

目的 旨在建立一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)平台鉴定结核分枝杆菌及检测结核耐药突变位点的方法,并对其用于临床耐药结核病检测的应用价值进行评估.方法 采用MALDI-TOF-MS检测 3 株国家参考品菌株,测定其对于结核鉴定位点和耐药位点的最低检出限.以非随机抽样法,收集昆明市第三人民医院结核科 2023 年 1 月至9 月疑似结核病患者呼吸道样本,包括痰液样本 120 例,肺泡灌洗液样本 100 例,每例样本含量 3～5 mL.供试样本均提取核酸,先用结核荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)试剂盒筛选出Ct值≤32 的结核阳性样本,然后用MALDI-TOF-MS检测与利福平(rifampicin,RIF)、异烟肼(isoniazide,INH)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、莫西沙星(moxifloxacin,MXF)、链霉素(streptomycin,SM)和吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)相关的耐药基因位点.同时采用表型药敏法和三代测序(Nanopore平台)对结核阳性样本进行检测并与MALDI-TOF-MS结果进行对比分析,验证其检测耐药结核的准确性.结果 对于结核鉴定位点IS6110 和ext_RD9,MALDI-TOF-MS的最低检出限为 60～100 CFU/mL;对于结核耐药位点,MALDI-TOF-MS的最低检出限为100～1000 CFU/mL.经qPCR法鉴定Ct值≤32 的结核阳性标本共 132 例.对比表型药敏结果,MALDI-TOF-MS检测耐药的敏感度、特异度和kappa值分别是:RIF为 93.75%、100%和 0.96;INH为 98.33%、90.28%和 0.88;EMB为 83.33%、97.50%和0.78;MXF为 95.45%、100%和 0.97.与三代测序结果相比,MALDI-TOF-MS检测耐药的敏感度、特异度和kappa值分别是:RIF 为 90.91%、100%和 0.94;INH 为 92.96%、100%和 0.92;EMB 为 92.86%、100%和 0.96;MXF 为95.45%、100%和 0.97;SM为 95.74%、100%和 0.97;PZA为 66.67%、100%和 0.80.结论 MALDI-TOF-MS针对抗结核药物的耐药检测结果与表型药敏和三代测序检测结果对比高度一致,可作为快速检测结核耐药的一种有效方法.

目的 构建可同时检测多个辐射相关基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的高通量、高分辨率、快速的方法.方法 选取 2020 年 4～6 月火箭军特色医学中心 75 例年满 18 周岁的健康男性为研究对象,采集外周血并提取DNA.文献筛选辐射相关17种基因28个SNP,设计多重PCR引物和单碱基延伸引物,通过PCR扩增和延伸,应用DP-TOF型飞行时间质谱检测系统对SNP位点进行基因分型,并对其中7份样本用Sanger测序法进行验证.结果 构建的28个SNP均分型成功.75份DNA样本28个SNP的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(martix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)检测结果显示基因分型检出率为 100.0%.7 份DNA样本 28 个SNP的基因型与Sanger测序结果完全符合,其准确度为 100.0%.结论 成功构建可同时检测 17种基因28个辐射相关SNP的核酸质谱检测技术平台,该方法具有高通量、快速准确的优点.

目的 探讨栖冷克吕沃尔氏菌临床株PD49对碳青霉烯类耐药的分子机制.方法 细菌鉴定和药敏分别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪和VITEK 2 Compact系统.碳青霉烯酶的检测通过NG-Test CARBA 5卡.基于Illumina MiSeq和Nanopore MinION技术平台对菌株测序,然后进行生物信息学分析.通过液相接合试验和S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)检测菌株所携带质粒的水平转移能力.结果 栖冷克吕沃尔氏菌临床株PD49对广谱头孢菌素敏感,环丙沙星和左氧氟沙星中介,厄他培南、亚胺培南和美罗培南耐药.通过测序平台获得了 PD49株的基因组序列,进一步的生物信息学分析显示:PD49株的染色体(命名为PD49-chr,4844 054 bp)携带blaKLUC-1基因以及多个外排泵基因;该菌株携带1个Co1KP3/IncX3型杂合质粒(命名为pPD49-OXA-181,51 479 bp),且blaOXA-181和qnrS1基因位于该质粒上.液相接合和S1-PFGE结果显示PD49株将携带的pPD49-OXA-181质粒传递到大肠埃希菌J53AziR.结论 本研究表明栖冷克吕沃尔氏菌临床株PD49对碳青霉烯类耐药的分子机制是因为该菌携带了blaOXA-181基因.经检索,同时携带blaKLUC-1、blaOXA-181和qnrS1基因的克吕沃尔氏菌为国内外首次报道.

目的 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)建立早期血流感染致病菌检测体系.方法 选取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、肺炎链球菌等10种临床最常见的病原菌作为检测对象,结合多重PCR技术和Mass ARRAY iPLEX单碱基延伸技术、MALDI-TOF MS技术,模拟细菌感染血液样本建立MALDI-TOF MS细菌核酸检测体系,测定其灵敏度;选取2017年3-5月在解放军总医院急诊科收集的疑似脓毒症患者血液样本33例对该体系进行验证,并将检测结果与微生物科血培养结果进行比较.结果 本研究所建立的MALDI-TOF质谱血液致病菌检测系统可同时检测分属两组的10种细菌,所有细菌样本均可见延伸峰;灵敏度为100CFU/ml;与33例临床血培养鉴定结果的阴性符合率为100％(27/27),6例血培养阳性样品中有2例为摩氏摩根菌和人葡萄球菌感染,因这两种细菌不包含在10种检测对象之内而未能通过质谱检出,其余4例血培养阳性样品与质谱检测结果的符合率为100％.结论 本研究建立的MALDI-TOF质谱检测体系可从全血样本中直接检测10种临床常见血流感染致病菌,无需进行培养,与传统血培养及生化鉴定相比具有耗时短、灵敏度高、准确度高等优势,可在一定程度上满足临床早期、快速诊断血流感染致病菌的需求.