目的:建立一种实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增（reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA）技术检测寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）的方法，以实现ZIKV的现场快速筛查及诊断。方法:通过基因组序列比对，选择ZIKV保守序列设计RT-RAA特异性引物和探针，并用系列稀释的ZIKV重组质粒与毒株核酸验证方法的灵敏性与重复性，通过检测登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒等其他虫媒病毒验证方法的特异性。结果:建立的RT-RAA方法可在39 ℃恒温条件下30 min内对ZIKV进行高效扩增，检测系列稀释的ZIKV重组质粒，其95%检测限可达到15拷贝/反应，特异性强，与登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒虫媒病毒无交叉反应，且重复性好。结论:本研究建立的ZIKV的RT-RAA等温扩增方法，具有反应迅速，无需精密仪器，操作简单等优点，适合于应急快速检测。

目的:基于重组酶介导的扩增技术(recombinase aided amplification，RAA)和CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)检测，建立一种快速、灵敏且特异的重要境外输入性病毒检测方法。方法:以流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus，YEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)、裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)为检测对象，设计特异性RAA扩增引物和CRISPR RNA(crRNA)，建立RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测反应，评价方法的灵敏度和特异性，使用登革热疑似临床样本进行检测，并与荧光RT-PCR技术进行比较，同时检测其余7种病毒临床模拟样本。结果:RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能在39 ℃条件下，40~52 min内检测出8种输入性传染病病原体，灵敏度达到1~10拷贝/μl，并且这8种病原体之间无交叉反应，临床样本均可100%检测出。结论:建立的RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能够灵敏、特异且快速地检测出8种境外输入性传染病病原体。

等温扩增技术是在恒温条件下进行扩增的一类新型核酸扩增技术。基于该技术建立的方法操作简便，且具有较高的灵敏度与特异性，在临床与科研等方面展现了较好的应用前景。本文就环介导等温扩增、交叉引物扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的等温扩增和滚环扩增等技术的原理、特点及应用进行了综述。

目的:建立基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）-规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas13a）准确检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）型碳青霉烯酶基因的方法。方法:收集2020—2021年北京市垂杨柳医院保存的25株产耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）临床分离株和5株碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（CSKP），提取菌株总DNA。设计检测KPC DNA特异性RAA引物和检测CRISPR RNA（crRNA），建立基于RAA-CRISPR-Cas13a技术快速准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。通过KPC质粒和临床样本菌株对方法进行评价，同时使用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）方法进行检测，比较2种方法的检出率和一致性。结果:本研究建立的RAA-CRISPR-Cas13a方法检测KPC质粒和样本的检测灵敏度均可达到1拷贝/μl，高于qPCR（10 1 拷贝/μl）。RAA-CRISPR-Cas13a检测方法和qPCR方法均从30株临床菌株（包含25株CRKP菌株和5株CSKP菌株）中检出23株携带KPC基因，7株未检出KPC基因，25株CRKP菌株中KPC基因检出率为92%（23/25），2种检测方法阳性符合率为100%（23/23）。 结论:将RAA扩增技术结合CRISPR-Cas13a技术，建立了一种准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。该方法有助于精准的筛选产KPC型碳青霉烯酶的菌株。

多重核酸检测技术具有可同时检测多个靶标、高通量、低成本等优势，满足大规模筛查、定量等检测需求。多重聚合酶链反应广泛应用于病原体、甲基化DNA和突变基因检测以及单核苷酸多态性分型；重组聚合酶扩增、环介导等温扩增等等温扩增技术在即时检测领域有很好的前景；基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统的多重核酸检测技术因其高灵敏度、高特异性成为新的研究热点；而宏基因测序在新发病原体突变监测和肿瘤学研究等领域发挥主导作用。本文对各种多核酸检测技术的临床应用现状及未来发展方向进行论述。

目的:基于逆转录重组酶介导的恒温扩增（reverse transcriptional recombinase aided amplification，RT-RAA）技术，建立一种快速，灵敏，简便的SARS-CoV-2棘突蛋白（S）H146Y突变检测方法。方法:针对SARS-CoV-2棘突蛋白H146Y突变区域设计RT-RAA特异性引物和荧光探针，使用优化的RT-RAA方法进行恒温扩增检测，评价方法的灵敏度和特异性，并与二代测序技术进行比较。结果:基于荧光信号的RT-RAA方法能在39 ℃，30 min完成检测，SARS-CoV-2 S蛋白H146（S-H146）野生株和Y146（S-Y146）突变株检测限均为10 copies/μL，能够依据荧光值明显区分S-H146毒株与S-Y146毒株的重组质粒或临床样本，且和五种常见呼吸道感染病毒无交叉反应，与二代测序技术方法一致性高。结论:建立的RT-RAA荧光检测方法具有灵敏度高，特异性强，适用于SARS-CoV-2 S蛋白H146Y突变株的快速检测，为基层医疗机构提供了新的鉴定方法。

目的:评价快速重组酶介导的等温扩增技术(RAA)在采供血机构沙门菌生物学监测中的应用。方法:加热快速裂解肠炎沙门菌标准菌株提取DNA，采用沙门菌RAA荧光型检测试剂在小型Genchek荧光检测仪内37 ℃条件下识别并扩增沙门菌的特异基因片段，20 min内实时读取荧光检测值，根据扩增曲线判定结果。评估RAA法的检测灵敏度，同时采用RAA法检测13个标准菌株和5个实验室分离的沙门菌株验证其特异性。采集51份样本，分别接种肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌标准菌株，以及无沙门菌污染的空白对照，营养琼脂平板培养48 h计数菌落数，同时采用国标GB 4789.4—2016的方法和RAA法进行沙门菌检测。结果:RAA法在37 ℃ 20 min的条件下对肠炎沙门菌的最低检出限为1.9×10 2 CFU/mL，和非沙门菌无交叉反应。使用中消毒液和血液运输箱内壁沙门菌生物学的检测结果与国标法相同，Kappa值均为1。 结论:RAA技术可快速、灵敏、特异性地检测沙门菌，可应用于采供血机构沙门菌的生物学监测。

目的:建立一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的特异性强、灵敏度高的猴痘病毒核酸检测方法。方法:根据已知猴痘病毒基因保守区设计合成重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification, RAA)引物和成簇规律间隔的短回文重复序列RNA(clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNA，CRISPR RNA, crRNA)，利用荧光检测技术筛选特异crRNA，通过荧光计数读取CRISPR/Cas12a检测结果，同时对所建立方法的灵敏性和特异性进行评价。结果:建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法，其灵敏度为2.5拷贝/反应，且与鼠痘病毒、痘苗病毒无交叉反应，具有高特异性。结论:建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法，为高效、快速、特异性检测猴痘病毒感染提供了有力工具。

目的 基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)拟建立一种简单快速的人腺病毒 4 型(HAdV-4)检测方法.方法 以HAdV-4的六邻体(Hexon)基因为靶标设计特异性引物与探针,利用构建的阳性质粒标准品,在 39℃、40℃、42℃条件下进行重组酶介导等温扩增,选出最佳反应温度,并对该方法进行灵敏度、重复性及特异性检测.使用实时荧光RAA测定法检测 100 份临床样本,并与实时荧光PCR检测结果进行比较,评估HAdV-4 实时荧光RAA测定法在临床样本中的检测性能.结果 最终确定了实时荧光RAA扩增最适温度为 42℃,该方法检测限为101 copies/μL.当质粒标准品浓度为101～104 copies/μL时,批内的变异系数均<5%,重复性良好.特异性检测结果显示,该方法可以准确检测HAdV-4而不与其他亚型和其他病原体发生交叉反应.100 例临床样本分别使用实时荧光PCR和实时荧光RAA测定法进行检测,两种方法的符合率为 100%.结论 本研究开发了一种特异且简便的HAdV-4快速检测方法.

目的 建立一种基于逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplifi-cation,RT-RAA)方法的人偏肺病毒快速分子诊断技术,并对其检测效果进行初步分析.方法 从NCBI数据库中下载人偏病毒基因组序列,利用Mega软件比对分析基因组序列,确定高度保守序列作为分子检测靶标.以人偏肺病毒N蛋白基因保守序列作为靶序列,设计引物和荧光探针.并以宁波地区人偏肺病毒基因组RNA为模板,利用实时荧光定量PCR对荧光RT-RAA检测体系进行评价.以构建含有N蛋白基因序列的不同浓度重组质粒为模板进行RT-RAA荧光扩增,分析其检测灵敏性;利用建立的RT-RAA荧光法分析检测人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和博卡病毒基因组,评价其检测特异性.结果 成功建立了人偏肺病毒RT-RAA扩增荧光检测方法,可在30 min内完成偏肺病毒的特异性扩增检测.以重组质粒为检测模板,RT-RAA荧光检测法的最低检出限为102拷贝/μL重组质粒,且均在15 min内出现阳性特异性扩增.与实时荧光定量PCR检测一致性达98.6％,且与其他3种病毒无交叉反应特性.结论 成功建立了一种基于RT-RAA扩增的人偏肺病毒荧光检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,在人偏病毒快速现场检测中具有潜在应用价值.