目的:探究负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）新生的影响及其机制。方法:采用实验研究方法。取第3~5代对数生长期HUVEC进行后续实验。取3批细胞，各批次细胞均分为常规培养24 h的正常对照组和单纯负压处理组以及加入17-丙烯胺基-17-去甲氨基格尔德霉素（17-AAG）培养24 h的单纯17-AAG组与17-AAG+负压处理组，另采用自行设计研发的全自动三维细胞梯度负压加载装置对2个负压处理组细胞行持续8 h的间歇负压吸引（负压值为-5.33 kPa，吸引30 s、暂停10 s），第1个批次细胞处理完成后于培养0（即刻）、24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平，样本数为6；第2个批次细胞处理完成后进行划痕试验，于划痕后12 h，在倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况后计算细胞迁移率，样本数为3；第3个批次细胞处理完成后进行小管形成实验，于培养6 h，在倒置相差显微镜下观察成管情况后计算细胞成管总长度与分支节点数，样本数为3。取细胞，分为正常对照组、单纯负压处理组、17-AAG+负压处理组，同前相应组别进行处理，处理完成后，采用蛋白质印迹法检测细胞中热休克蛋白90（HSP90）、窖蛋白1、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、eNOS磷酸化位点1177蛋白表达并计算eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值（样本数为3），采用免疫共沉淀（共沉淀HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS）与蛋白质印迹法检测各组细胞中窖蛋白1、eNOS的蛋白表达（样本数为3），采用免疫荧光双重染色法评估细胞中HSP90与窖蛋白1、窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位情况。通过HADDOCK 2.4蛋白质-蛋白质对接程序对窖蛋白1和eNOS进行分子对接预测。数据分析采用析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD法。结果:与正常对照组相比，单纯17-AAG组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低（ P<0.01），单纯负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显升高（ P<0.01）；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养48、72 h均明显升高（ P<0.05或 P<0.01）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养24、48、72 h均明显降低（ P<0.01）。划痕后12 h，与正常对照组的（39.9±2.7）%相比，单纯17-AAG组细胞迁移率明显降低［（10.7±2.7）%， P<0.01］，单纯负压处理组细胞迁移率明显升高［（61.9±2.4）%， P<0.01］；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显升高［（37.7±3.7）%， P<0.01］；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显降低（ P<0.01）。处理完成后培养6 h，与正常对照组相比，单纯17-AAG组细胞成管总长度明显缩短（ P<0.05）且分支节点数明显减少（ P<0.05），单纯负压处理组细胞成管总长度明显延长（ P<0.01）且分支节点数明显增加（ P<0.01）；与单纯17-AAG组相比，17-AAG+负压处理组细胞成管分支节点数明显增加（ P<0.05）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞成管总长度明显缩短（ P<0.01）且分支节点数明显减少（ P<0.01）。蛋白质印迹法检测显示，处理完成后，3组细胞中eNOS、窖蛋白1蛋白表达总体比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；单纯负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显高于正常对照组（ P<0.01），17-AAG+负压处理组细胞中HSP90蛋白表达与eNOS磷酸化位点1177/eNOS比值均明显低于单纯负压处理组（ P<0.01）。处理完成后免疫共沉淀与蛋白质印迹法检测显示，与正常对照组相比，单纯负压处理组细胞中窖蛋白1蛋白表达明显升高（ P<0.01），eNOS蛋白表达明显降低（ P<0.05）；与单纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组处理完成后细胞中窖蛋白1蛋白表达明显降低（ P<0.01），eNOS蛋白表达明显升高（ P<0.01）。处理完成后，与正常对照组相比，单纯负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显增多，窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显减少；与单纯负压处理组比，17-AAG+负压处理组细胞中HSP90与窖蛋白1的蛋白共定位明显减少，窖蛋白1与eNOS的蛋白共定位明显增多。分子对接预测提示，窖蛋白1与eNOS相互作用较强，抑制eNOS 1177位点的磷酸化。 结论:负压微环境可能通过促进HUVEC中HSP90结合窖蛋白1进而抑制窖蛋白1结合eNOS，以解除窖蛋白1对eNOS 1177位点磷酸化的抑制，从而促进HUVEC增殖、迁移和成管，最终促进HUVEC新生。

目的:通过体外培养神经细胞(SH-SY5Y)观察FK1706对神经细胞再生的作用并探讨其机制。方法:体外培养SH-SY5Y细胞，根据不同处理分别分为FK1706组、神经生长因子组(NGF)、FK1706＋NGF组、FK1706＋NGF＋格尔德霉素(Geldanamycin)组和空白对照组。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同组细胞增殖活性，测量细胞轴突长度。分子生物学检测不同细胞中磷酸化促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(p-Raf)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、p-Raf/Raf及p-ERK/ERK表达水平。通过免疫共沉淀(IP)检测不同细胞中热休克蛋白90(HSP90)与Raf结合的复合体表达水平。使用方差分析比较各组间数据。结果:CCK-8检测显示FK1706＋NGF组细胞增殖活性最强(1.12±0.08)，高于FK1706组和NGF组(0.61±0.07、0.89±0.04)，差异有统计学意义( t＝6.824， P<0.05)，加入格尔德霉素可以抑制其增殖活性(0.31±0.02)；FK1706＋NGF组细胞轴突最长，轴突长度为(277.40±18.64) μm，高于FK1706组和NGF组[(71.24±6.12)、(144.61±11.20) μm]，差异有统计学意义( t＝14.577， P<0.05)，FK1706＋NGF＋格尔德霉素组轴突长度[(97.06±11.29) μm]低于FK1706＋NGF组；NGF组p-Raf、p-ERK表达水平分别为(0.58±0.02)和(1.24±0.03)，高于对照组(0.25±0.03、0.76±0.02)和FK1706组(0.23±0.02、0.78±0.03， t1＝23.335， t2＝9.163， P<0.05)，差异有统计学意义，加入FK1706可以增强NGF组p-Raf和p-ERK的表达水平( t1＝21.213， t2＝2.191， P<0.05)，差异有统计学意义，加入格尔德霉素可以抑制FK1706和NGF的协同作用，与细胞轴突长度和增殖活性检测结果一致。IP检测显示FK1706＋NGF组HSP90/Raf复合体相对表达水平最高(1.56±0.04)，显著高于其他组( t＝16.398， P<0.05)，差异有统计学意义，FK1706＋NGF＋格尔德霉素组HSP90/Raf的表达水平(0.93±0.05)低于FK1706组和FK1706＋NGF组。 结论:FK1706可以促进HSP90和Raf结合，提高大鼠肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶/促分裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(Ras/Raf/MAPK/ERK)信号通路中Raf和ERK磷酸化水平，促进神经细胞增殖和轴突生长。

目的 探讨17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)对PD-1人源化小鼠人肝癌移植肿瘤生长的抑制作用.方法 选取30只PD-1人源化小鼠,将HepG2细胞悬液注射于小鼠右侧腹股沟皮下组织,构建人肝癌移植瘤模型;将荷瘤人源化小鼠随机分为3组(每组10只):①模型组(注射生理盐水10 mg/kg);②17-DMAG组(按25 mg/kg腹腔注射17-DMAG,3次/周);③顺铂组(腹腔注射20 mg/kg,2次/周),实验持续4周.注射结束后测量人源化小鼠移植瘤的长、短径计算体积,测量肿瘤质量计算抑瘤率,同时采用免疫组化方法检测肿瘤组织中CD31(以阳性细胞数计算肿瘤微血管密度(MVD))及血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 17-DMAG 组和顺铂组的肿瘤体积和质量均较模型组显著减小(P＜0.05),17-DMAG组的抑瘤率略高于顺铂组,但17-DMAG组和顺铂组肿瘤质量和体积以及抑瘤率均不存在显著性差异.17-DMAG组和顺铂组MVD标记微血管数量及VEGF表达均低于模型组(P＜0.05),且17-DMAG组又低于顺铂组(P＜0.05).结论 17-DMAG可显著降低肝癌移植瘤中VEGF的表达,抑制新生血管在肿瘤中发生发展,从而对人源化小鼠肝癌移植瘤发挥抑制作用.

[目的]对链霉菌Streptomyce sp.FIM18-0592 进行菌种鉴定,并对其胞外格尔德霉素产量进行发酵工艺优化,旨在提高产量并降低发酵成本.[方法]通过形态特征、培养特征和生理生化特性,结合 16S rDNA序列分析构建系统发育树进行菌种鉴定;采用单因素试验优化培养条件及培养基配方,进一步使用最陡爬坡试验和响应面试验优化培养基配方的含量.[结果]通过对链霉菌FIM18-0592 的形态特征、培养特征及生理生化特征进行初步培养观察发现,其在ISP2 等培养基上生长较好,气生菌丝旺盛,产黑色素.结合 16S rDNA分子鉴定,确定该菌为格尔德霉素链霉菌(Streptomyces geldanamycininus).通过单因素试验对发酵条件以及培养基配方进行优化,得到最适宜菌株发酵的培养条件为转速 140 r/min、装液量 12%(体积分数)、接种量 7%(体积分数)、培养时间 144 h.最佳的碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、黄豆饼粉和硫酸铵.采用最陡爬坡试验和响应面优化试验确定了其最优的发酵培养基为:葡萄糖 10.42%、黄豆饼粉 1.68%、硫酸铵 0.3%、乳酸 0.3%、甘油 4%、硫酸镁 0.1%、碳酸钙 0.4%,在此条件下,格尔德霉素的发酵效价达到 2 887 μg/mL,较原始发酵工艺效价提高了 66%.[结论]链霉菌FIM18-0592 为格尔德霉素链霉菌,通过对其发酵工艺进行优化显著提高格尔德霉素的产量,为格尔德霉素及其衍生物的开发和利用奠定基础.

目的 探讨热休克蛋白90(HSP90)抑制剂17-烯丙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对人绒毛膜癌JAR细胞系细胞周期和凋亡的影响及其相关机制.方法 体外培养人绒毛膜癌JAR细胞系,经不同浓度的17-AAG作用24 h后,采用TUNEL细胞凋亡法及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR法和Western blotting法检测血管内皮生长因子(VEGF)、cyclinD1、cyclinA1和Caspase-3在mRNA和蛋白水平的表达情况.结果 17-AAG对JAR细胞生长具有明显的抑制作用,并存在浓度依赖性.各组细胞发生G2期阻滞及明显凋亡;5、10、20 mg/L 17-AAG作用24 h后,各组细胞增殖相关基因cyclinD1mRNA及蛋白表达水平相对于0 mg/L 17-AAG处理组(对照组)均下调,VEGF蛋白表达水平相对于0 mg/L 17-AAG处理组(对照组)下调,且下调程度与处理浓度成正比,而凋亡相关基因Caspase-3的mRNA未出现明显上调,但其在蛋白表达水平上调.结论 17-AAG能够抑制JAR细胞增殖活力,诱导细胞凋亡,17-AAG可能通过下调VEGF的表达,产生抗肿瘤血管新生作用;可能通过下调cyclinD1使细胞周期发生G2期阻滞;且可能通过上调Caspase-3诱导细胞凋亡.

目的 研究格尔德霉素和环孢素(热休克蛋白90与钙调磷酸酯酶抑制剂)抗阿萨希毛孢子菌活性,及联合常用抗真菌药物后的体外药物敏感性.方法 通过美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的M27-A3肉汤稀释法检测格尔德霉素和环孢素对21株阿萨希毛孢子菌临床株的体外抗真菌活性,棋盘微量液基稀释法检测上述2种抑制剂与5种常用抗真菌药(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B和卡泊芬净)的相互作用.结果 格尔德霉素对阿萨希毛孢子菌临床株有较好的体外抗真菌活性,而环孢素作用较弱.此外,格尔德霉素和环孢素与5种常用抗真菌药联合使用,均显示具有良好的体外抗阿萨希毛孢子菌协同作用.结论 格尔德霉素和环孢素可以提高常用抗真菌药对阿萨希毛孢子菌的敏感性,提示一种针对侵袭性毛孢子菌病的潜在治疗策略.

目的 探讨17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔得霉素(17-AAG) 对人绒癌JAR 细胞迁移和黏附的影响.方法 MTT 实验: 以5、10、20、40 μg/mL 浓度的17-AAG 处理绒癌JAR 细胞(实验组) ,设立空白对照组,空白对照组为与实验组相同体积的培养基,培养24 h后观察细胞形态,MTT 法检测细胞增殖抑制率,并计算IC50.划痕治愈实验: 以5、10 μg/mL 浓度的17-AAG 及空白对照组处理绒癌JAR 细胞(实验组) ,进行细胞划痕治愈实验,划痕后即刻及48 h后,拍照记录细胞划痕治愈情况,并计算划痕治愈率.Transwell实验:以5、10、20、40 μg/mL 浓度的17-AAG 处理绒癌JAR 细胞(实验组) ,设立空白对照组,培养12 h后,Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力.Western blot实验: 以5、10、20、40 μg/mL 浓度17-AAG 处理绒癌JAR 细胞(实验组) ,设立空白对照组,培养24 h后,蛋白免疫印迹(Western blot) 法检测细胞迁移黏附相关蛋白表达水平.结果 MTT 实验结果 显示,与空白对照组比较,实验组细胞增殖抑制率明显增加,呈浓度依赖性(P ＜ 0. 05) ,24 h后IC50均值为11. 951;划痕治愈实验结果 显示,与对照组比较,实验组划痕覆盖面积明显降低(P ＜ 0. 05);Transwell实验结果 显示,与空白对照组比较,实验组细胞穿膜数目逐渐降低,呈浓度依赖性(P ＜ 0. 05);Western blot实验结果 显示,与空白对照组比较,实验组E-cadherin蛋白表达水平显著增加(P ＜ 0. 05) ,同时N-cadherin、β-catenin蛋白表达水平降低(P ＜ 0. 05) .结论 17-AAG 能够抑制人绒癌JAR细胞增殖,并通过EMT 信号通路上调E-cadherin蛋白,下调N-cadherin、β-catenin蛋白的表达抑制人绒癌JAR 细胞的迁移和黏附.

甲型流行性感冒是一种人群易感、症状明显、死亡率高的疾病.目前主要抗病毒药物治疗效果并不理想.热休克蛋白是机体中一类氨基酸序列高度保守,具有分子伴侣、抗凋亡、调节免疫等多种保护性功能的应激蛋白.研究发现热休克蛋白在甲型流感病毒的生命循环中起着激活病毒复制活性、稳定病毒客户蛋白等至关重要的作用.这一机制的发现为以热休克蛋白为靶点研发抗病毒药物提供了新的思路.以格尔德霉素为代表的热休克蛋白抑制剂作为重点候选药物成为了研究热点.

目的 观察热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对间充质干细胞C3H10T1/2增殖、凋亡及成骨分化的影响.方法 用0、0.001、0.010、0.100和1.000 μmol/L浓度17-AAG处理C3H10T1/2,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测C3H10T1/2增殖;流式细胞术检测0、0.1和1.0 μmol/L浓度17-AAG作用下细胞的凋亡率;0、0.1、0.5、1.0 μmol/L 17-AAG处理后,Western blot检测凋亡相关蛋白的变化,半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3试剂盒检测Caspase-3酶活性的变化;0、0.01 μmol/L17-AAG处理后,碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性测定检测两组成骨分化的强弱.结果 0、0.001、0.010、0.100和1.000 μmol/L 17-AAG处理细胞后,随着浓度增加,C3H10T1/2的生长增殖明显受到抑制,呈时间浓度依耐性.流式细胞术检测,0、0.1、1.0 μmol/L 3组凋亡率分别为(1.36±0.43)％、(5.37±1.10)％、(13.30±1.94)％,0.1、1.0 μmol/L组较对照组差异均有统计学意义(P=0.014、0.011),0.1、1.0μmol/L两组之间差异也有统计学意义(P=0.048).Western blot结果显示随着17-AAG浓度的升高,抗凋亡蛋白B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)减少,促凋亡蛋白bcl-2相关X蛋白(bax)、BH3结构域凋亡诱导蛋白(bid)表达增加.Caspase-3活性测定17-AAG浓度0.1、0.5、1.0 μmol/L组与对照组比值分别为1.84 ±0.11、2.19±0.13、2.79 ±0.24,与对照组比较差异均有统计学意义(P =0.006,P=0.004,P=0.006).成骨诱导14d,0.01 μmol/L组ALP染色比未处理组颜色加深,0.01 μmol/L组ALP活力与对照组ALP活力比值为1.646 ±0.139,差异有统计学意义(P=0.015).结论 高浓度17-AAG抑制间充质干细胞C3H10T1/2的增殖,促进其凋亡,低浓度17-AAG能促进C3H10T1/2的成骨分化.

目的 探讨热休克蛋白90 (Hsp90)抑制剂WK-88-1对人乳腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响. 方法 MTT实验检测不同浓度的WK-88-1(1.562 5,3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L)对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞存活率的影响;集落克隆实验检测不同浓度的WK-88-1 (0.1,0.3,0.5μmol/L)对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞集落形成的影响;细胞划痕实验和Transwell小室法检测WK-88-1对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞迁移和侵袭的影响;免疫印迹法检测WK-88-1对Hsp90顾客蛋白缺氧诱导因子-1 α(HIF-1α)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的影响. 结果 WK-88-1具有抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖的作用,且呈现浓度和时间依赖性(P＜0.05).MDA-MB-231和MCF-7经不同浓度的WK-88-1处理后,癌细胞的迁移和侵袭能力显著下降(P＜0.05).免疫印迹法结果显示,随着WK-88-1给药浓度(12.5,25,50μmol/L)的增加,细胞内的HIF-1α和MMP-9蛋白的表达均下调. 结论 非苯醌格尔德霉素WK-88-1能够显著抑制人乳腺癌细胞迁移与侵袭,其机制可能与下调Hsp90的顾客蛋白HIF-1α和MMP-9有关.