目的:评价黄芪甲苷对帕金森病小鼠黑质磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法:SPF级健康雄性C57BL/6小鼠45只，8周龄，体重19~25 g，采用随机数字表法分为3组( n＝15)：对照组(C组)、帕金森病组(PD组)和黄芪甲苷组(A组)。采用连续7 d每天腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)30 mg/kg的方法制备小鼠帕金森病模型，A组连续7 d于注射MPTP前30 min每天腹腔注射黄芪甲苷20 mg/kg，C组腹腔注射等量生理盐水。给药完成后间隔1 d时测定行为学。随后处死小鼠取脑组织黑质，采用Western blot法检测酪氨酸羟化酶(TH)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。 结果:与C组比较，PD组和A组运动总距离和下落潜伏期缩短，悬挂评分降低，步宽增加，黑质TH、p-PI3K、p-Akt和BDNF表达下调，GFAP表达上调( P<0.05)；与PD组比较，A组运动总距离和下落潜伏期延长，悬挂评分升高，步宽减少，黑质TH、p-PI3K、p-Akt和BDNF表达上调，GFAP表达下调( P<0.05)。 结论:黄芪甲苷改善帕金森小鼠运动功能障碍的机制与激活PI3K/Akt信号通路，上调BDNF表达，抑制星形胶质细胞活化有关。

目的:设计合成 68Ga-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-半胱氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(CDV)-Nb109，探讨其用于检测不同肿瘤中程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)表达水平的潜力。 方法:采用基因工程技术将CDV引入单域抗体Nb109序列的尾部，通过马来酰亚胺-半胱氨酸定点偶联策略，将马来酰亚胺-DOTA与CDV-Nb109(物质的量比1∶1)反应制备前体DOTA-CDV-Nb109，随后进行 68Ga标记并用PD-10脱盐柱纯化。建立人黑色素瘤A375、人源性PD-L1转染的A375-hPD-L1及人胶质瘤U87荷瘤裸鼠模型，通过稳定性分析、细胞摄取和microPET显像评价 68Ga-DOTA-CDV-Nb109的诊断价值。采用单因素方差分析和最小显著差异 t检验分析数据。 结果:68Ga-DOTA-CDV-Nb109放射化学产率为(69.79±4.69)%，放化纯大于97%，摩尔活度为(12.85±1.51) GBq/μmol。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109与A375-hPD-L1细胞具有较强的亲和力，解离常数( Kd)为(66.43±17.89) nmol/L。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109在A375-hPD-L1细胞[(3.17±0.15)百分加入放射性剂量(%AD)]、U87细胞[(2.08±0.03) %AD]中的摄取明显高于A375细胞[(1.21±0.14) %AD； F＝82.87， t值：15.23、9.98， P值：<0.001、0.003]。 68Ga-DOTA-CDV-Nb109在A375-hPD-L1[(5.21±0.35)每毫升百分注射剂量率(%ID/ml)]和U87[(3.44±0.69) %ID/ml]荷瘤裸鼠肿瘤中的摄取显著高于A375荷瘤裸鼠[(2.17±0.36) %ID/ml； F＝249.72， t值：35.70、3.43，均 P<0.001]。 结论:成功制得定点标记的PET探针 68Ga-DOTA-CDV-Nb109，可无创、动态监测不同肿瘤中PD-L1表达水平的变化，在PD-L1免疫检查点阻断治疗潜在受益患者筛选方面具有应用潜力。

目的:分析微RNA-506(miR-506)对M2型巨噬细胞极化及胰腺癌小鼠免疫干预的影响。方法:体外培养健康志愿者外周血来源单核细胞，诱导为M1或M2型巨噬细胞，分别转染miR-506或阴性对照序列(miR-ctrl)。收集M1+miR-ctrl组、M1+miR-506组、M2+miR-ctrl组和M2+miR-506组极化巨噬细胞，以聚合酶链反应检测M1和M2型巨噬细胞标志性基因相对表达，并检测四组巨噬细胞功能：吞噬功能和一氧化氮(NO)合成(M1型巨噬细胞特征性功能)，精氨酸酶1活性和血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)分泌(M2型巨噬细胞特征性功能)。60只无特定病原体健康雄性C57BL/6小鼠，体重20~25 g，建立胰腺癌原位成瘤模型，随机分为miR-ctrl PD-1组、miR-506 PD-1组、miR-ctrl iso组、miR-506 iso组，分别注射miR-506、miR-ctrl、程序性死亡蛋白-1(PD-1)抗体、同型对照抗体，每组15只。3周后检测肿瘤体积和重量、Ki-67、γ干扰素。 结果:与M2+miR-ctrl组比较，M2+miR-506组M1型巨噬细胞标志性基因mRNA相对表达升高，M2型巨噬细胞标志性基因mRNA相对表达降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与M2+miR-ctrl组比较，M2+miR-506组巨噬细胞吞噬功能和NO合成升高，精氨酸酶1活性以及VEGF、TGF-β、IL-10分泌水平下降，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。miR-ctrl iso组与miR-ctrl PD-1组肿瘤重量、肿瘤体积、Ki-67、γ干扰素比较，差异均无统计学意义(均 P>0.05)。miR-506 PD-1组肿瘤重量、肿瘤体积、Ki-67低于miR-ctrl PD-1组[(0.32±0.13)g比(0.85±0.24)g；(0.72±0.23)cm 3比(2.03±0.21)cm 3；(25.9±10.3)%比(55.6±12.5)%]，γ干扰素高于miR-ctrl PD-1组[(122.4±15.3)ng/g比(82.4±22.2)ng/g]，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:miR-506抑制M2型巨噬细胞极化，miR-506增强PD-1抗体对小鼠胰腺癌的抑制作用。

目的:制备融合C3Fab的抗程序性死亡-配体1（PD-L1）纳米抗体P3C8-C3Fab，并研究其对血浆半衰期的影响。方法:将来源于蛋白G的C3Fab肽段，通过DNA重组技术与纳米抗体P3C8进行分子融合，并构建重组质粒pET21a-P3C8-C3Fab，在大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达和纯化，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测P3C8-C3Fab与PD-L1蛋白、小鼠IgG和表达PD-L1肿瘤细胞的结合，利用双抗夹心ELISA检测不同时间小鼠血清中残留P3C8-C3Fab，以评估C3Fab对PD-L1纳米抗体血浆半衰期的延长作用。结果:成功构建了融合C3Fab的抗PD-L1纳米抗体P3C8-C3Fab，其在BL21菌中以可溶形式高效表达，经纯化获得质量分数约为90%的NbP3C8-C3Fab蛋白，得率为7.18 mg/L。P3C8-C3Fab随着质量浓度的增加，对PD-L1蛋白和小鼠IgG亲和力也逐渐升高，且呈现浓度相关性；P3C8-C3Fab与肺癌A549细胞的结合呈浓度相关性。小鼠血清中P3C8-C3Fab的浓度标准曲线呈典型的S型浓度相关性；P3C8血浆半衰期仅为0.44 h，而P3C8-C3Fab的血浆半衰期达到9.36 h，血浆半衰期延长了21.27倍。结论:C3Fab与纳米抗体P3C8连接可以显著延长其血浆半衰期，对改善纳米抗体的体内作用具有应用价值。

目的:探究人胎盘源间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)通过CD73/核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)途径抑制CD4 ＋IFN-γ ＋T(Th1)细胞分泌TNF-α减轻急性移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)小鼠肝损伤的作用机制。 方法:流式细胞术分析GVHD小鼠外周血和肝组织中Th1细胞对TNF-α的表达以及CD4 ＋IFN-γ ＋TNF-α ＋T(TNF-α ＋Th1)细胞上PD-1的表达水平。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、马松(Masson)染色和免疫荧光染色观察各组GVHD小鼠肝组织病理变化，并进一步用HE染色观察各组GVHD小鼠皮肤和肺组织病理变化。体外建立非条件性外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)向Th1细胞诱导方案，检测TNF-α ＋Th1细胞比例以及其Nrf2和磷酸化细胞核内核因子-κB(phosphorylated nuclear factor-kappa B，p-NF-κB)的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。 结果:与正常对照组相比，GVHD发病高峰组小鼠外周血和肝组织中TNF-α ＋Th1细胞比例和TNF-α ＋Th1细胞对PD-1的表达明显升高( P<0.01)；hPMSCs干预可降低小鼠外周血和肝组织中TNF-α ＋Th1细胞比例( P<0.001)，促进小鼠外周血和肝组织中TNF-α ＋Th1细胞对PD-1的表达( P<0.01， P<0.001)，然而shCD73对小鼠外周血和肝组织中TNF-α ＋Th1细胞的干预效果明显减弱( P<0.05， P<0.01)。肝组织病理学分析结果显示，肝脏中TNF-α ＋Th1细胞比例分别与Suzuki′s评分、胶原面积和α-SMA的MFI呈正相关( P<0.001)。同样，皮肤和肺组织病理学分析结果也显示，外周血中TNF-α ＋Th1细胞比例分别与皮肤的Cetkovic-Cvrlje评分和肺的Qiao Shukai评分呈正相关( P<0.001)。PBMCs活化实验也显示hPMSCs能下调TNF-α ＋Th1细胞比例( P<0.01)，上调TNF-α ＋Th1细胞对PD-1的表达( P<0.05)；进一步分析发现hPMSCs可增强TNF-α ＋Th1细胞中Nrf2的MFI( P<0.05)，减弱p-NF-κB的MFI( P<0.01)。 结论:hPMSCs可能通过CD73/Nrf2途径上调PD1的表达，抑制TNF-α ＋Th1细胞形成，进而减轻GVHD小鼠肝损伤。

黏液是肠黏膜屏障的第1道防线，其核心成分是黏蛋白。谷氨酰胺是杯状细胞的重要能量物质，它可以促进黏液合成，减轻烧伤后肠道黏液屏障的损伤，但其机制尚不十分清楚。该研究利用烧伤脓毒症的动物和细胞模型，重点研究谷氨酰胺对黏蛋白2合成和修饰的影响的分子机制。作者观察到前梯度蛋白2（AGR2）在黏蛋白2的翻译后修饰中起着关键作用。烧伤脓毒症诱导的氧化应激促进了AGR2的S‐谷胱甘肽化，干扰了AGR2对黏蛋白2前体的加工和修饰，并阻断了成熟黏蛋白2的合成。进一步研究表明，由葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶（G6PD）催化的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）是抑制氧化应激和调节AGR2活性的关键分子。谷氨酰胺可通过己糖胺途径促进G6PD的O‐连接N‐乙酰葡糖胺修饰，这有助于G6PD同源二聚体的形成并增加NADPH的合成，从而抑制AGR2的S‐谷胱甘肽化并促进黏蛋白2成熟，最终减轻烧伤脓毒症小鼠肠道黏液屏障的损伤。综上，该文证实谷氨酰胺在促进黏蛋白2 成熟和维持肠道黏液屏障方面的核心机制是促进G6PD 糖基化和抑制AGR2的S‐谷胱甘肽化。

目的:验证天然状态间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exosome）治疗小鼠急性移植物抗宿主病（GVHD）的效果和可能机制，探索并建立定向基因修饰MSC-exosome的方法并验证修饰后MSC-exosome的功能。方法:构建小鼠急性GVHD模型，观察比较不同剂量MSC-exosome组和MSC组的生理指标评分、生存和体重减低程度；进而通过体外T细胞活化实验和体内OVA抗原特异性T细胞活化实验检测比较组间活化T细胞的增殖水平。构建重组表达载体，获得携带PD-L1和PD-L1-ITGB1的AAV2YF3突变体，进而感染人MSC，分离获得其外泌体。检测比较天然状态和修饰后MSC-exosome在体外和体内对活化T细胞的增殖水平和调节性T细胞（Treg）比例的影响。结果:①MSC-exosome（300 μg×3次）和小鼠MSC（1×10 6×3次）均能够有效改善急性GVHD小鼠的生理指标评分、生存和体重减低程度。②相比IL-2对照组，10、25、50 μg人MSC-exosome和1×10 6人MSC体外共孵育处理均能够抑制活化T细胞的增殖，增殖比例分别为86.0%（IL-2）、40.0%、39.6%、42.8%和41.0%；相比PBS对照组，50、100、200 μg小鼠MSC-exosome和1×10 6小鼠MSC在体内均能够抑制抗原特异性活化的OT-1细胞的增殖，增殖比例分别为42.6%、33.1%、14.2%、10.6%和14.6%。③携带PD-L1和PD-L1-ITGB1的AAV2YF3突变体定向修饰人MSC-exosome的表达率分别超过40%和60%。④相比天然状态，PD-L1和PD-L1-ITGB1定向修饰后MSC-exosome在体内对抗原特异性活化的OT-1细胞具有更好的增殖抑制效果；在体外亦能明显抑制活化T细胞的增殖，并诱导提高Treg的比例。 结论:MSC-exosome具有与MSC相似的免疫调节作用。经过PD-L1和PD-L1-ITGB1修饰后的MSC-exosome能够有效抑制活化T细胞的增殖，并且能够诱导提高Treg的比例。

目的:探讨miR-15b-5p参与PD中抑郁样行为发生的机制。方法:（1）将18只C57BL/6N小鼠按随机数字表法分为PD组、干预组及对照组，每组6只。PD组小鼠通过脑立体定位仪将0.25 mg/kg鱼藤酮注射至右侧纹状体以制备PD模型，干预组小鼠接受0.25 mg/kg鱼藤酮及miR-15b-5p抑制物慢病毒注射，对照组小鼠注射等体积PBS。4周后进行旷场实验及转棒实验评价小鼠的运动能力，进行糖水偏好实验及强迫游泳实验评价小鼠的抑郁样行为表现，然后提取小鼠黑质及纹状体中相关蛋白及miRNAs，进行Western blotting实验、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）实验以及免疫荧光染色实验检测相关指标[miR-15b-5p、酪氨酸羟化酶（TH）、脑源性神经营养因子（BDNF）、原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）、突触后密度蛋白95（PSD95）]。（2）将100 nmol/L miR-15b-5p模拟物/抑制物序列及各自阴性对照序列分别转染至6孔板上SH-SY5Y细胞中（分别命名为miR-15b-5p模拟物组、miR-15b-5p模拟物对照组及miR-15b-5p抑制物组、miR-15b-5p抑制物对照组），48 h后进行Western blotting实验及qRT-PCR实验，以检测BDNF、TrkB、PSD95蛋白及miR-15b-5p表达改变。（3）将100 ng BDNF 3'端非编码区（3'-UTR）野生型或突变型荧光素酶报告载体质粒以及100 nmol/L miR-15b-5p模拟物/抑制物序列及各自阴性对照序列共转染至24孔板上SH-SY5Y细胞中，得到相应8组细胞，48 h后进行荧光素酶报告载体活性检测实验，以检测各组细胞的荧光素酶活性。结果:（1）与对照组相比，PD组小鼠的运动速度明显减慢、落棒潜伏期明显缩短、糖水偏好百分比明显降低、不动时间明显增加；与PD组相比，干预组小鼠的运动速度明显提高、落棒潜伏期明显延长、糖水偏好百分比明显升高，不动时间明显减少；差异均有统计学意义（ P<0.05）。（2）与miR-15b-5p模拟物对照组比较，miR-15b-5p模拟物组细胞中miR-15b-5p表达明显升高，BDNF、TrkB、PSD95表达明显降低（100.00±5.75 vs. 66.79±5.90；100.00±5.95 vs. 84.46±5.77；100.00±7.02 vs. 80.43±3.25）；与miR-15b-5p抑制物对照组比较，miR-15b-5p抑制物组细胞中miR-15b-5p表达明显降低，BDNF、TrkB、PSD95表达明显升高（100.00±6.81 vs. 119.90±5.66；100.00±2.88 vs. 110.10±4.15；100.00±2.19 vs. 124.60±11.69）；差异均有统计学意义（ P<0.05）。与对照组相比，PD组小鼠黑质中miR-15b-5p表达明显增加，TH、BDNF、TrkB、PSD95表达明显降低（100.00±9.20 vs. 63.60±12.80；100.00±9.88 vs. 71.95±10.00；100.00±5.16 vs. 70.37±8.43；100.00±7.01 vs. 68.12±10.22），BDNF荧光强度明显降低（100.00±12.99 vs. 48.23±12.58）；与PD组相比，干预组小鼠黑质中miR-15b-5p表达明显降低，TH、BDNF、TrkB、PSD95表达明显升高（63.60±12.80 vs. 90.69±9.84；71.95±10.00 vs. 93.31±4.50；70.37±8.43 vs. 88.11±4.10；68.12±10.22 vs. 89.59±5.93），BDNF荧光强度明显升高（48.23±12.58 vs. 83.65±10.52）；差异均有统计学意义（ P<0.05）。（3）与BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p模拟物对照组比较，BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p模拟物组细胞中荧光素酶活性明显降低（100.00±5.07 vs. 90.59±1.75）；与BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p抑制物对照组比较，BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p抑制物组细胞中荧光素酶活性明显升高（100.00±5.08 vs. 152.20±31.87）；差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:miR-15b-5p通过下调BDNF/TrkB/PSD95表达参与PD中抑郁样行为发生。

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

目的:探讨低强度超声激励微泡空化(USMC)产生的血流增强效应联合PD-L1单抗对实体肿瘤免疫微环境的改善作用。方法:将MC38结肠癌荷瘤小鼠随机分为四组：对照组(26只，无任何治疗)、USMC组(27只，USMC治疗)、程序性细胞死亡蛋白配体1抗体(anti-PD-L1)组(27只，anti-PD-L1治疗)和USMC+anti-PD-L1组(27只，USMC联合anti-PD-L1治疗)。USMC治疗使用VINNO70超声诊疗一体机。采用超声造影评价肿瘤血流增强效应；通过绘制肿瘤生长曲线及记录小鼠生存期，评价抗肿瘤疗效；流式细胞术分析肿瘤内CD8 +T细胞数量及功能、CD4 +T细胞分化情况、骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)比例及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的极化表型分布；酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测肿瘤内趋化因子CXCL9、CXCL10及HIF-1α含量；免疫荧光分析肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达。 结果:USMC治疗后超声造影分析肿瘤峰值强度(PI)、曲线下面积(AUC)较治疗前增加(均 P<0.05)。USMC联合anti-PD-L1治疗明显抑制了肿瘤进展。USMC+anti-PD-L1组治疗后肿瘤微环境中CD8 +T细胞量及其Ki67的表达、γ干扰素(IFN-γ)与颗粒酶B(Grzm-B)的分泌量高于其他3组，辅助性T细胞(Th1)比例增加，调节性T细胞(Tregs)、MDSC比例减少，TAM表型向M1型极化(均 P<0.05)。ELISA分析显示，联合治疗还提高了肿瘤中CXCL9、CXCL10的浓度，降低了HIF-1α的含量(均 P<0.05)；肿瘤组织VEGF的荧光表达量也显著低于对照组( P<0.05)。 结论:超声血流增强效应联合PD-L1单抗能改善实体肿瘤免疫微环境，USMC产生的血流增强效应可作为一种增效PD-L1抗体肿瘤免疫治疗的超声新方法。