毛建草(Dracocephalum rupestre)是一种重要的药用植物.然而,其叶片外植体再生系统尚未建立.以毛建草大田叶片和组培苗叶片为外植体,探讨植物生长调节剂对愈伤组织诱导和分化、不定芽增殖及生根的影响,建立了叶片离体再生体系.结果表明,大田叶片愈伤组织诱导的最适培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 IAA,诱导率达84.51％,不定芽分化最佳培养基为MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 IAA,分化率为66.37％;组培苗叶片愈伤组织诱导的最适培养基为MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 IAA,诱导率达86.73％,不定芽分化最佳培养基为MS+2.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 TDZ+0.05 mg·L-1 IAA,分化率为53.48％.不定芽增殖适宜培养基为MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA,增殖率为83.57％,最适生根培养基为 1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 IBA,生根率为86.97％;在草炭:蛭石=1∶1(v/v)的混合基质中组培苗长势最好.该研究建立了毛建草叶片离体培养再生体系,为毛建草种质资源保存和种苗快繁提供了技术支持.

穿心莲为我国重要的南药之一,用于清热解毒、凉血消肿,其主要活性成分穿心莲内酯具有抗癌、抗HIV病毒、抗炎、保肝等功效.然而,穿心莲内酯人工合成难度较大,主要从人工栽培的植物原料中提取,栽培植物原料的质量因受土壤、气候、水肥管理等各种因素的影响而参差不齐,穿心莲生长周期长且占用土地资源.植物离体培养技术在种苗快繁及活性成分积累等方面都具有显著优势,是实现穿心莲活性成分快速、高效生产的重要途径之一.穿心莲组织离体再生技术体系日益完善,从外植体到完整植株的组织离体再生技术日渐成熟,已在种苗繁育、倍性育种等方面有了一定的应用.同时,在穿心莲愈伤组织培养、细胞悬浮培养、不定根培养、毛状根培养过程中,通过优化培养条件和使用适宜的诱导子可大幅增加培养物中穿心莲内酯等活性成分的积累.该文分别从穿心莲组织、细胞、不定根及毛状根培养等方面,全面系统地综述了近年来国内外关于穿心莲离体培养技术以及其生产穿心莲内酯的研究进展,以期促进穿心莲离体培养技术的发展与应用,为离体生产穿心莲内酯的研究提供参考.此外,还提出了未来在穿心莲离体培养技术及通过该技术生产穿心莲内酯的研究中需重点关注的 3 个方面:(1)熟化完善穿心莲组织离体再生技术体系,建立全面系统的评价体系;(2)优化培养条件和高效诱导子联用,进一步提高穿心莲内酯等重要活性成分产量;(3)开展通过细胞悬浮培养技术生产穿心莲内酯的生物反应器培养研究.

为建立银扇草(Lunaria annua)体外再生体系,以其真叶为外植体,探讨消毒条件、植物生长调节剂组合及浓度对愈伤组织诱导、不定芽和不定根分化的影响;进一步分析了生根方式对成苗和幼苗生长的影响.结果表明,用75％乙醇消毒45秒配合0.1％升汞溶液消毒6分钟为银扇草叶片外植体最佳消毒处理;真叶愈伤组织诱导及不定芽分化的最适培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2,4-D,愈伤组织诱导率达93.37％,不定芽分化率达84.08％;最佳生根培养基为MS+0.1 mg·L-1 NAA,从接种叶片外植体到获得再生植株约90天.该研究建立了银扇草稳定的再生体系,为开发利用银扇草资源及挖掘功能基因奠定了基础.

毛华菊(Chrysanthemum vestitum)是栽培菊花(C.× morifolium)的近缘六倍体野生种之一,其自然群体中的舌状花与栽培菊花一样具有典型的平瓣型、管瓣型和混合瓣型变异,是研究菊属植物瓣型变异的理想材料.其舌状花发育过程受生长素和花器官发育关键差异基因的影响,但目前缺乏稳定高效的不同瓣型毛华菊株系的再生体系,制约了毛华菊瓣型相关基因的研究.利用在河南省伏牛山收集的3种瓣型毛华菊株系,以叶片和茎间薄层为外植体建立再生体系.结果表明,以平瓣型叶片为外植体,其愈伤组织诱导和不定芽分化最佳培养基为MS+1 mg-L-1 NAA+2 mg-L-1 6-BA,接种20天愈伤组织诱导率为100％,不定芽分化率达100％;最佳生根培养基为1/2MS+0.2 mg-L-1 NAA,生根率达100％.平瓣型毛华菊的叶片最佳再生体系也适用于管瓣型和混合瓣型株系,不定芽分化率分别为83.46％和91.67％,生根率均为100％.移栽后对开花植株进行观察,发现利用叶片再生体系获得的3种不同瓣型再生植株花型稳定,为后续利用不同瓣型株系解析舌状花形态变异机理提供了技术方法.

为研究高能碳离子束对马铃薯组培苗茎切段的影响,以马铃薯品种'新大坪'的组培苗茎切段为研究材料,设置4个辐照剂量梯度对其进行辐照处理,测定植株致死率、生根率、侧芽形成率、形态变异率以及叶片生理指标,确定'新大坪'组培苗茎切段的半致死辐照剂量.结果表明:辐照剂量与致死率之间的关系呈正相关性;组培苗茎切段的再生植株表型变化主要为叶片不对称、叶缘不规则、茎变异伸长、叶片丛生和叶片粘连等;随辐照剂量升高,超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势;丙二醛含量则呈先升后降,随后又升高的现象.利用线性回归方程计算'新大坪'的半致死辐照剂量为20.37 Gy.

目的:建立浙麦冬组织培养快繁体系,为其规模化生产提供技术支撑.方法:以'浙麦冬 1 号'嫩叶基部为外植体,研究植物生长调节剂对诱导愈伤组织、不定芽分化和不定根形成的影响,并进行了炼苗与移栽.结果:'浙麦冬 1 号'愈伤组织诱导最适培养基为MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂2.5 g/L+活性炭2.0 g/L,诱导率为 92.22%;愈伤组织分化不定芽最适培养基为MS+KT 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂 2.5 g/L+活性炭 2.0 g/L,不定芽分化率达88.89%;最适生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖 30.0 g/L +琼脂 2.5 g/L,生根率为 96.67%;组培苗经驯化,2 周后移栽成活率为 89.00%.结论:建立了'浙麦冬 1 号'组织培养快繁体系.

目的:建立党参花药培养的植株再生体系,为党参单倍体育种提供基础研究.方法:以党参花药为外植体,研究不同浓度 2,4-D、低温预处理对愈伤组织诱导的影响,并对愈伤组织进行继代培养及体细胞胚胎发生再生植株研究.结果:确定了花粉发育时期与花蕾外部形态的相关性,药瓣比(花药长/花瓣长)为0.83～0.89 的党参花蕾,其花粉处于单核中央期或单核靠边期;党参花药愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+1.0～2.0 mg/L 2,4-D+蔗糖30 g/L+琼脂 8 g/L,诱导率为 37.50%～47.50%;低温预处理对愈伤组织诱导的效果不明显;合适的愈伤组织继代、胚状体分化再生植株的培养基分别为MS+0.5 mg/L 2,4-D+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L、MS+0.5 mg/L 2,4-D+椰乳100 g/L +蔗糖 30 g/L+琼脂 8 g/L.结论:初步建立了通过体细胞胚胎发生再生植株的党参花药培养技术体系,为党参新品种选育奠定了基础.

为创制棉花耐旱种质资源,解决棉花耐旱资源贫乏以及提高水资源利用率,研究依据CRISPR/Cas9编辑原理,对课题组前期利用RT-PCR技术筛选耐旱相关基因GhNAC3(Gh_D02G0790)的第一外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在陆地棉基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与gRNA-AtU6载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的AtU6-GhNAC3表达盒,再将表达盒连接到CRISPR/Cas9(pRGEB32-7)载体上,获得CRISPR-GhNAC3重组表达载体,利用农杆菌介导法转化陆地棉受体YZ-1,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR检测Cas9蛋白基因获得阳性株系.对T0代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定GhNAC3编辑类型.结果发现,CRISPR9-GhNAC3表达载体成功转化YZ-1,并获得40株转基因再生植株,经Cas9蛋白基因鉴定得到30株阳性株系,从阳性植株选择10株进行编辑类型测序分析,发现7株在靶点区域发生编辑,编辑类型主要为碱基片段缺失,缺失片段大小为3～28 bp,T1代种植于大田,获得了同时出现黄化和矮化的突变体3株.

该研究建立了黑鹅绒海芋(Alocasia reginula)体细胞胚胎发生途径的植株再生体系.通过叶柄诱导获得胚性愈伤组织,以此建立胚性细胞悬浮培养系,并实现了高频率的植株再生.叶柄外植体在添加2.0 mg·L-1 2,4-D和1.0 mg·L-1 TDZ的MS培养基上诱导胚性愈伤组织的效率最高(达81.3％).将胚性愈伤组织破碎成细胞团,转移至添加2.0 mg·L-1 2,4-D和1.0 mg·L-1 TDZ的MS液体培养基中进行悬浮培养,2周继代1次,悬浮培养12周后获得大量细胞团.将悬浮培养28周的细胞团转移至不含植物生长调节剂的1/2MS固体培养基上进行分化培养,平均每个细胞团可再生2.3-2.5棵植株.利用光学显微镜和扫描电镜观察体细胞胚的萌发和形成.再生苗移栽至温室4个月后,成活率为95.3％.通过流式细胞术对随机选取的50株成活植株进行检测,未发现染色体倍性变异,核DNA含量为10.94 pg·(2C)-1,基因组大小为5 290.12 Mb·C-1.植株移栽到温室直至自然开花,表型无明显变异.研究结果可为黑鹅绒海芋种苗商业化生产和生物技术育种提供良好的技术支持.

目的:通过中华猕猴桃花药培养获得单倍体或双单倍体再生植株,以期创新猕猴桃种质,为猕猴桃育种提供材料.方法:以中华猕猴桃栽培品种'桂海四号'雄株花药为外植体,研究不同培养基对愈伤组织诱导、体细胞胚诱导、继代及植株再生的影响,采用流式细胞仪鉴定再生植株倍性.结果:花药在添加1 mg/L 2,4-D和5 mg/L 6-BA培养基上诱导率最高,为58.48%,愈伤组织为淡黄色、结构致密.上述愈伤组织在添加2,4-D的培养基中未形成体细胞胚,而其它激素配比均可产生体细胞胚,在体视镜下可观察到球形胚、心形胚和鱼雷胚阶段.体细胞胚在添加0.05 mg/L NAA、1 mg/L 6-BA 和 0.5 mg/L IBA的培养基上增殖率最高,为53.30%,且状况良好.在添加不同浓度IBA和ZT培养基上,体细胞胚均可分化产生丛生芽,当IBA为0.05 mg/L、ZT为3 mg/L时其再生率最高,为40%.再生植株在添加0.5 mg/L IBA的培养基上生根效果最佳,根多且粗壮.经流式细胞仪鉴定出单倍体、双倍体、三倍体、四倍体和五倍体多种倍性再生植株.结论:该研究初步建立花药—愈伤组织—体细胞胚—植株再生的培养体系,可为中华猕猴桃或其它猕猴桃物种的花药培养提供借鉴,再生单倍体或双单倍体植株是猕猴桃新种质,可为猕猴桃育种提供重要材料.