[目的]探究无患子(Sapindus mukorossi Gaertn.)雄性不育品种'琦蕊'雄花不同发育时期的细胞学特征及差异表达基因,为深入解析无患子雄性不育发生的分子机制提供理论依据.[方法]在观察雄花花药不同发育过程的细胞学特点基础上,进一步利用RNA-Seq技术分别对小孢子母细胞时期(T1)、四分体时期(T2)、单核小孢子时期(T3)的雄花进行转录组比较分析,筛选关键差异表达基因.[结果]'琦蕊'绒毡层和内层细胞的持续膨大与增殖使得药室结构混乱,药室空间不足,最终导致无可育花粉产生.内源激素测定发现,茉莉酸水平在'琦蕊'雄花发育过程中呈下降趋势.3 个时期的转录组分析共筛选到 2 990 个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中T2_vs_T1 中 722 个(516 个上调,206 个下调),T3_vs_T2 中 1 741 个(765个上调,976 个下调).GO和KEGG分析表明,这些DEGs主要富集在代谢过程、细胞分裂、花粉壁合成、激素信号转导等方面,共鉴定到 32 个花粉发育相关DEGs、27 个激素合成及信号转导DEGs.随机选取 9 个DEGs进行RT-qPCR分析,结果与RNA-Seq数据趋势一致,证明转录组数据的准确性.[结论]绒毡层细胞持续增殖和内层细胞延迟退化不断挤压小孢子是导致无患子'琦蕊'雄性不育发生的主要原因,物质代谢、细胞分裂、激素水平、花粉发育等相关基因在雄性不育发生过程中发挥重要作用.

[目的]研究湖北黄精花部形态结构特征和大小孢子发生及雌雄配子体发育过程,以丰富黄精属植物的生殖生物学理论,为进一步开展湖北黄精的品种选育提供依据.[方法]以不同发育时期的湖北黄精花芽为试验材料,用显微观察法观察花部形态结构特征,石蜡切片技术对单花雌雄蕊进行切片观察.[结果]湖北黄精的花被为白色或淡黄绿色,花被筒近喉部稍缢缩;具6枚雄蕊,花丝下端与花被合生,花药开裂方式为纵裂;雌蕊子房上位,3心皮,花柱与子房等长.湖北黄精花药壁由4层细胞组成,成熟的绒毡层具多核,绒毡层发育类型为分泌型;小孢子母细胞减数分裂为连续型,四分体呈左右对称型排列,成熟花粉粒为2-细胞型;存在小孢子发育不同步的现象.雌蕊胚珠具双珠被、厚珠心;四分体呈直线型排列,胚囊发育类型为蓼型;存在双胚囊胚珠现象.在雄蕊的花药壁和雌蕊的子房壁都观察到有束状草酸钙针晶.[结论]湖北黄精雌雄蕊具有较原始的发育特征,虽然在发育过程中都存在异常现象,但雄蕊最终能形成正常的雄配子体,雌蕊低频率的双胚囊现象对总体受精结果影响很小.湖北黄精杂交育种可以选择花药开裂前一时期的花粉,花药壁和子房壁观察到的束状草酸钙针晶无法作为湖北黄精物种鉴定的依据.

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国目前的主栽油菜类型,其花蕾发育包含一系列复杂的代谢和调控过程,尤其是小孢子成熟前的早期发育过程对油菜育性影响较大.本研究首先通过组织形态学观察,确定甘蓝型油菜花蕾大小在 1～3 mm时期,对应于雄蕊发育的 5～9期.利用高通量的HPLC-MS/MS质谱测序技术,对该发育时段的花蕾进行蛋白质组学分析,共鉴定到13 444 个蛋白,比较各时期鉴定到的蛋白筛选出613 个差异表达蛋白.对差异蛋白的功能进行分析,发现细胞壁建成、脂质代谢、细胞转运相关蛋白大量上调,这将有利于花蕾发育过程中的细胞建成和花粉发育;核酸相关蛋白表达与含量变化迅速,这与该时段细胞的急剧分裂与生长的代谢过程一致;而ABCDE发育模型相关蛋白的表达未发生显著变化,可能具有除诱导花蕾分化外的其他功能.研究结果说明油菜花蕾发育早期细胞代谢旺盛,大量代谢相关蛋白发生了显著变化,这将为进一步分析花蕾发育过程中的代谢及调控过程提供基础.

被子植物中部分类群的花药开裂方式为孔裂,人们对此类花药的发育与散粉孔的形成及散粉机制了解甚少.杜鹃属(Rhododendron)植物的花药普遍为顶孔开裂,为探究其花药的发育和散粉孔的形成及散粉机制,该研究对锦绣杜鹃(Rhododendron × pulchrum)进行了解剖观察和石蜡切片.结果表明:(1)锦绣杜鹃花药顶端成孔区与花药主体具有不同的组织构成,成孔区由薄壁组织构成,起源于雄蕊原基顶端的分生组织,花粉成熟时薄壁细胞分解成为散粉孔;花药的主体由孢原细胞发育而来,孢原细胞经多次分裂分化成为具多层花药壁的花粉囊.(2)锦绣杜鹃的花药壁在小孢子母细胞至小孢子四分体时期发育完全,有6～7层细胞,包括1层表皮、2～3层药室内壁、1～2层中层和1层绒毡层,中层在小孢子四分体形成后即分解,绒毡层在花粉完全成熟前分解消失,花药壁在花粉成熟时有表皮和2～3层药室内壁.(3)与纵裂型花药不同,锦绣杜鹃的药室内壁在花粉成熟时不发生纤维化,但因积累多糖而增厚,具有韧性和弹性.(4)锦绣杜鹃花粉发育过程中小孢子母细胞产生的4个小孢子不分离,成熟花粉为四合花粉,花粉间具有粘丝.推测锦绣杜鹃具多层药室内壁且加厚可使花粉囊空间缩小,从而将上部花粉"挤出"散粉孔,而花粉间的粘丝使昆虫传粉时可将花粉成团带出,其药室内壁多层且积累多糖是与顶孔开裂相适应的特征.

兜兰属的分类系统学争议较大,亟待更多资料澄清.该文利用体式解剖镜和石蜡切片技术观察了紫纹兜兰的花结构和双雄蕊花药发育特征.结果表明:(1)花形态特征支持将紫纹兜兰放置于兜兰亚属的单花斑叶组,包括萼片具脉纹、花瓣长圆形带黑褐斑,唇瓣具直立的耳状结构,退化雄蕊新月形等.(2)花药原基分化出一对侧生并列的药室,花药室中央分化出一条不完全贯穿的不育隔膜组织,将其分化为两个小孢子囊.在花药成熟时,不育隔膜组织被降解吸收,两个花粉囊通过次生融合形成一枚马鞍形的黏性花粉团.(3)发育完整的花药壁有4层,由外到内分别为表皮、药室内壁、中层和绒毡层,符合单子叶型花药壁.花药壁具绒毡层和内绒毡层,均为2核.在2-细胞花粉时期,中层和绒毡层发生降解,药室内壁发生纤维状加厚.(4)小孢子母细胞经同时型胞质分裂形成不同排列方式的小孢子四分体,包括正四面体、左右对称和十字交叉型,并且同一药室的小孢子母细胞减数分裂不同步现象明显.(5)在雄配子体发育阶段,小孢子或保持在四分体内或从四分体中游离出来,经有丝分裂发育为2-细胞型花粉,形成具有黏性的四合花粉或花粉粒.基于现有资料,该文比较分析了紫纹兜兰不完全贯穿的不育隔膜组织、单子叶型花药壁、具2核的绒毡层和内绒毡层、同时型胞质分裂和黏性花药等特征的分类学意义,为理解兜兰属及杓兰亚科的分类学和保护生物学提供新资料.

峨眉拟单性木兰(Parakmeria omeiensis)是木兰科(Magnoliaceae)拟单性木兰属(Parakmeria)的常绿乔木,属于国家Ⅰ级保护的极度濒危植物.为探究峨眉拟单性木兰两性花中雄性败育发生的时期及花药不同发育时期的生理生化特性,以两性花中的不育雄蕊和雄花中的可育雄蕊为材料,利用石蜡切片观察2种雄蕊的花药发育过程,并测定不同发育时期的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量,分析过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性.结果表明:(1)不育雄蕊与可育雄蕊在减速分裂时期出现明显差异,不育雄蕊的绒毡层致密、没有发育,四分体未形成,随后解体,花粉囊中无花粉;可育雄蕊的绒毡层和小孢子母细胞发育正常,成熟时花粉囊开裂,花粉粒溢出.(2)不育雄蕊的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量,在减数分裂时期、单核期和花粉成熟期都显著低于可育雄蕊.(3)不育雄蕊POD活性整体呈上升趋势,在减数分裂时期、单核期和花粉成熟期都显著高于可育雄蕊;不育雄蕊CAT活性整体呈下降趋势,显著低于同时期的可育雄蕊.综上认为,两性花中雄性败育发生在减速分裂时期,其败育的主要原因是物质能量代谢降低,绒毡层没有进一步发育,不能给小孢子母细胞提供营养物质;过氧化氢酶及过氧化物酶的活性异常,造成细胞内不能及时清除自由基,使小孢子母细胞的减数分裂受阻,无法形成四分体.该研究结果为深入开展峨眉拟单性木兰雄性不育的分子机制、性系统演化机制研究奠定了基础.

川芎是著名的川产道地药材,原植物Ligusticum chuanxiong长期采用无性栽培,存在有性生殖障碍,制约其种质创新.该研究基于比较解剖学研究思路,通过形态解剖、石蜡切片、染色压片以及结合扫描电镜技术,对川芎及其近缘野生藁本L.sinense的生殖生长各个阶段的花部特征、果实、种子进行了比较研究.结果表明川芎花药花粉母细胞减数第二次分裂期间存在异常,四分体时期小孢子大小不均匀、数量不一致;花药发育过程中绒毡层细胞未退化完全;花粉成熟期,花药壁存在细微裂缝,花药大部分不能正常释放花粉;成熟花粉粒表面凹陷、部分畸形,花粉无活力且不能进行体外萌发,花粉内淀粉、多糖和脂类物质明显不足;川芎开花盛期花丝较短,向下反曲;果期可见双悬果,但果实干瘪,种子皱缩.对比观察同期藁本,花药发育正常,花粉粒有活力,双悬果饱满;开花盛期,花丝较长且直立,明显高于柱头.川芎和藁本子房内均可见成熟胚囊,未见明显不同,柱头也无明显差异.结论认为,川芎雄蕊发育过程中,花粉母细胞减数分裂、四分体、绒毡层、花丝等结构异常发育,川芎具有雄性不育特征,是其有性生殖障碍的重要原因.

目的:建立党参花药培养的植株再生体系,为党参单倍体育种提供基础研究.方法:以党参花药为外植体,研究不同浓度 2,4-D、低温预处理对愈伤组织诱导的影响,并对愈伤组织进行继代培养及体细胞胚胎发生再生植株研究.结果:确定了花粉发育时期与花蕾外部形态的相关性,药瓣比(花药长/花瓣长)为0.83～0.89 的党参花蕾,其花粉处于单核中央期或单核靠边期;党参花药愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+1.0～2.0 mg/L 2,4-D+蔗糖30 g/L+琼脂 8 g/L,诱导率为 37.50%～47.50%;低温预处理对愈伤组织诱导的效果不明显;合适的愈伤组织继代、胚状体分化再生植株的培养基分别为MS+0.5 mg/L 2,4-D+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L、MS+0.5 mg/L 2,4-D+椰乳100 g/L +蔗糖 30 g/L+琼脂 8 g/L.结论:初步建立了通过体细胞胚胎发生再生植株的党参花药培养技术体系,为党参新品种选育奠定了基础.

玉米突变体male-sterile 20s2(ms20s2)是在玉米自交系KWS49中发现的一个无花粉型雄性不育突变体.与野生型相比,ms20s2突变体花药细小且颜色偏浅,花药内未观察到花粉.扫描电镜观察表明,与野生型相比,9叶期突变体ms20s2的花药中未观察到正在减数分裂的花粉母细胞;抽雄后突变体花药壁外部角质层形成异常,内部未观察到乌式体结构.观察不同发育阶段花药的石蜡切片发现,在S6-S7时期,与野生型相比,ms20s2突变体花药部分中间层和绒毡层细胞发生异常分裂,导致花药壁萎缩,花粉母细胞无法正常进行减数分裂,最终造成花粉母细胞死亡,产生雄性不育表型.遗传分析表明,突变体ms20s2的雄性不育表型受单个隐性核基因控制.利用玉米10K SNP芯片对F2定位群体进行基因型分析,初步将该突变位点定位在玉米2号染色体长臂上6.21 Mb区段内.进一步精细定位将该区间缩小到了 590 kb,区间包含一个已知的蛋白编码基因MS32(Zm00001eb106620).对MS32基因进行测序分析,在突变体MS32基因4号外显子上发现了一段3166 bp的大片段插入,可能影响了 MS32蛋白功能,造成ms20s2的花药发育异常和雄性不育的表型.等位测验结果表明,突变体ms20s2是雄性不育基因MS32的新等位突变体.组织表达分析发现该基因在玉米花药中特异表达,且仅在花药发育的S6和S7时期表达量较高,进一步验证了该基因在玉米花药绒毡层和中间层细胞发育过程中的重要作用.

砂引草属(Messerschmidia L.)在紫草科(Boraginaceae Juss.)分类系统里位置不稳定,为更好地理解砂引草属的分类学位置,利用常规石蜡制片技术结合光学显微镜观察了砂引草(Messerschmidia sibirica L.)的大小孢子发生及雌雄配子体发育特征.结果如下:(1)花药4室,成熟花药壁由表皮、药室内壁、1层中层和绒毡层共4层细胞构成,双子叶型花药壁发育类型,分泌型绒毡层,成熟绒毡层细胞含2核,表皮宿存,药室内壁不规则2层,具纤维性加厚;(2)小孢子母细胞减数分裂过程中胞质分裂为同时型,小孢子四分体四面体型排列,成熟花粉粒为2-细胞型;(3)胚珠倒生,单珠被,珠孔狭长,具珠被绒毡层,假厚珠心,部分珠心组织宿存至成熟胚囊时期;(4)胚囊发育类型为蓼型,成熟胚囊梭形,极核在受精前融合,反足细胞退化早.砂引草胚胎学特征与天芥菜属(Heliotropium)其他种类胚胎学特征十分相似,稍有不同,鉴于胚胎学特征在属内较为稳定,支持分子系统中将砂引草属置于天芥菜属的分类学处理.