诱导多能干细胞(iPSC)是通过导入外源基因或在培养基中加入化学物质等方法使体细胞去分化而获得.与胚胎干细胞类似,iPSC可以分化形成三种胚层细胞系.iPSC能通过二维分化方法(如单层细胞培养和共培养),或拟胚体诱导法和基于支架的三维细胞培养方法分化为心肌细胞.iPSC分化成心肌细胞的过程还需通过激活或抑制特定的信号通路(如Wnt、BMP、Notch信号通路)来模拟体内心脏发育过程.近年来,通过生物反应器进行细胞悬浮培养,已能产生足够数量的iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CM).iPSC-CM在移植前需要通过代谢调节和细胞分选等方法进行纯化,以消除可能导致畸胎瘤形成的未分化iPSC.目前,iPSC-CM的主要移植方法为细胞悬液注射和细胞片移植.动物实验研究表明,将iPSC-CM移植到梗死心肌中能改善心脏功能.本文综述了上述关于iPSC-CM治疗急性心肌梗死的临床前相关研究,并讨论了iPSC-CM在临床应用中的局限性和挑战,以期为iPSC-CM的临床转化研究提供参考.

目的:构建一种稳定高效的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向软骨中胚层方向分化的培养方法,初步探究hiPSCs来源的软骨用于关节软骨再生的可能.方法:通过模拟体内发育过程和三维(three dimensions,3D)悬浮培养体系,逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层和成熟的软骨组织分化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光及免疫组织化学技术检测整个培养过程中多能干性、中胚层及软骨相关基因和蛋白的动态变化;最后利用裸鼠皮下模型研究hiPSCs软骨球软骨表型的稳定性及成瘤性.结果:通过模拟体内发育过程,成功逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化,最终分化为成熟的软骨组织.结论:本研究成功构建了一种稳定高效诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化的培养体系,为探究hiPSCs介导的软骨组织发育和再生提供了一个研究平台.

目的:建立海南地区引种温郁金Curcuma wenyujin的悬浮细胞系,并初步研究离体培养材料中挥发性成分的积累.方法:甄选诱导愈伤组织的外植体、培养基以及悬浮细胞起始愈伤组织等,建立稳定的悬浮细胞系;采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定温郁金悬浮细胞团等离体培养材料中莪术挥发油等挥发性成分.结果:嫩根诱导的愈伤组织是建立稳定悬浮细胞系的适宜起始材料;愈伤组织继代培养2次后增殖较明显,可形成颜色鲜黄、颗粒均一、疏松易碎的胚性愈伤组织;三种离体培养材料中,常见挥发性物质总量检出率依次为组培苗、悬浮细胞团、愈伤组织;莪术挥发油中常见化学成分牻牛儿酮、莪术烯、莪术二酮、榄香烯等总量的检出率依次为组培苗、愈伤组织、悬浮细胞团.结论:海南地区引种温郁金悬浮细胞系等离体培养材料均积累了一定量的莪术油等挥发性有效成分,为进一步筛选优化培养体系、促进培养物次生代谢物的积累提供了基础研究.

目的:制备Nb2C/3D打印氮化硅(Si3N4)复合组织工程支架,研究其对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3细胞增殖活性影响.方法:采用3D打印技术制备Si3N4支架,由Nb2AlC粉末通过HCl-LiF水热原位腐蚀、剥离处理制备得到Nb2C纳米片悬浮液,将Si3N4支架浸泡于1.5 mg/mL Nb2C纳米溶液获得Nb2C生物涂层,制备Si3N4、Nb2C/Si3N4支架浸提液孵育小鼠胚胎成骨细胞,CCK-8检测空白组、2％DMSO阳性对照组、Si3 N4组、Nb2 C/Si3N4组孵育的MC3T3 细胞增殖活性.结果:与空白组相比,阳性对照组细胞增殖活性显著性降低(P<0.05);与Si3N4组比较,Nb2C/Si3 N4组的MC3T3 细胞增殖活性显著提高(P<0.05).结论:Nb2C/Si3N4生物涂层支架能促进MC3T3 细胞增殖,是一种有应用潜力的骨组织工程材料.

该研究建立了黑鹅绒海芋(Alocasia reginula)体细胞胚胎发生途径的植株再生体系.通过叶柄诱导获得胚性愈伤组织,以此建立胚性细胞悬浮培养系,并实现了高频率的植株再生.叶柄外植体在添加2.0 mg·L-1 2,4-D和1.0 mg·L-1 TDZ的MS培养基上诱导胚性愈伤组织的效率最高(达81.3％).将胚性愈伤组织破碎成细胞团,转移至添加2.0 mg·L-1 2,4-D和1.0 mg·L-1 TDZ的MS液体培养基中进行悬浮培养,2周继代1次,悬浮培养12周后获得大量细胞团.将悬浮培养28周的细胞团转移至不含植物生长调节剂的1/2MS固体培养基上进行分化培养,平均每个细胞团可再生2.3-2.5棵植株.利用光学显微镜和扫描电镜观察体细胞胚的萌发和形成.再生苗移栽至温室4个月后,成活率为95.3％.通过流式细胞术对随机选取的50株成活植株进行检测,未发现染色体倍性变异,核DNA含量为10.94 pg·(2C)-1,基因组大小为5 290.12 Mb·C-1.植株移栽到温室直至自然开花,表型无明显变异.研究结果可为黑鹅绒海芋种苗商业化生产和生物技术育种提供良好的技术支持.

基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率.简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态.探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题.首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制.结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强.当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程.过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降.柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程.控制转染时柠檬酸铁铵浓度在 20 μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用.本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293 细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考.

目的:比较二维平铺法和三维悬滴法两种培养体系对小鼠胚胎期生血内皮细胞体外诱导生成造血产物的支持作用.方法:分别利用二维平铺法和三维悬滴法将流式细胞术分选的造血干细胞潜能的生血内皮细胞PK44(CD41-CD43-CD45-CD31+ CD201+ Kit+ CD44+)群体与OP9-DL1-GFP基质细胞共孵育6 d后,在显微镜下观察两种培养体系产生造血产物的形态特点;利用流式细胞术分析两种培养体系孵育后的造血产物,并统计分析造血产物的比例和绝对数量;分别对两种培养体系共孵育后的造血产物进行造血细胞集落形成单位培养(colony-forming unit culture,CFU-C)实验,并对不同形态的细胞集落进行计数.结果:(1)利用二维平铺法形成的造血细胞平铺或悬浮于基质细胞上,而利用三维悬滴法共孵育后的产物形成了以基质细胞为中心,造血细胞黏附在周围的细胞聚集体.(2)二维平铺法产生更多CD45+造血细胞;三维悬滴法对造血产物的分化具有谱系偏向性,更有利于肥大细胞的分化.(3)二维平铺法诱导生血内皮的分化产物在体外CFU-C实验中可以产生更多的造血集落.结论:二维平铺法更支持小鼠胚内生血内皮细胞体外诱导产生CD45+的造血细胞以及有集落形成能力的造血干祖细胞.

目的:建立致心律失常性右室心肌病(ARVC)患者特异性的诱导性多能干细胞(iPSCs),为研究ARVC发病机制提供研究模型.方法:培养来源于ARVC患者皮肤成纤维细胞,并进行突变位点测序鉴定.通过仙台病毒转导入外源性多能转录因子,将ARVC患者皮肤细胞诱导为iPSCs,结合免疫荧光法,实时荧光定量PCR,以及体内外三胚层形成实验对iPS细胞全能型进行鉴定.通过调控Wnt信号通路诱导iPS细胞定向分化为心肌细胞.结果:ARVC患者来源的iPSCs显示碱性磷酸酶阳性,多能性相关基因高表达,胚胎干细胞标志物Oct4,SSEA4,TRA-1-81阳性.体外悬浮培养形成的拟胚体以及体内畸胎瘤形成实验均显示ARVC-iPSCs具有向3个胚层分化能力.经过体外心肌定向,ARVC-iPSC可诱导产生自主节律性搏动细胞团,免疫荧光显示cTnT阳性.结论:本研究使用仙台病毒,建立了无插入型ARVC患者特异的诱导性多能干细胞系,该细胞系具有多能分化特性,并可定向分化为心肌细胞,为研究ARVC的致病因素和药物筛选提供宝贵的实验模型.

本研究中,以楸树未成熟种胚为外植体,对楸树胚性细胞悬浮系的培养进行研究,初步建立了楸树胚性细胞悬浮系与植株再生体系.通过组织培养技术,将楸树未成熟种胚分别接种在添加不同植物生长调节剂的1/2MS基本培养基上,进行胚性愈伤组织诱导及增殖,以15d为一个周期,将得到的胚性愈伤组织置于添加聚乙二醇6000 (PEG6000)(0,5％,10％,15％,20％)的1/2 MS的悬浮培养液中进行振荡培养,建立分散性好、增殖快、稳定性较强的细胞悬浮系.将悬浮培养获得的胚性材料转移到不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基中,体胚萌发同步性高,并可再生植株,对实现楸树周年生长、进行产业化开发具有重要意义.

目的 以尿液脱落细胞为来源,构建先天性马蹄内翻足患者特异的诱导多能干细胞(iPSCs).方法 收集先天性马蹄内翻足患者尿液180 ml,通过离心,分离出尿液脱落细胞并进行培养,然后使用病毒系统对该细胞进行重编程,获得状态良好的细胞并进行鉴定,鉴定方法包括多能性基因检测、碱性磷酸酶(ALP)染色、核型鉴定、流式细胞仪(FACS)检测表面标志物、拟胚体(EB)悬浮球实验和甲基化检测等多种检测手段.结果 获得的细胞多能性基因表达与人胚胎干细胞H9相似,ALP染色呈强阳性,核型正常,多能性标记Tra-1-60阳性率为84.1％,能形成大量EB悬浮球,细胞在Nanog同源框(NANOG)和有机阳离子/肉毒碱运输蛋白4(Oct4)基因启动子区域的甲基化基本消失,证实获得的细胞具有多能性干细胞的所有特征,确定为iPSCs.结论 本实验成功构建了先天性马蹄内翻足患者特异iPSCs,为明晰先天性马蹄内翻足的演变特征提供了疾病模型.