目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

[目的]通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平,并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析,旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础.[方法]利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达,首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1 和Ydj1 分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用,并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析.[结果]TPRK在毕赤酵母GS115 中表达,其最适反应条件为 65℃、pH 9.0,且具有良好的热稳定性和pH稳定性.过表达ssa1、hac1、erj5 和sil1 基因的重组菌株酶活分别提升了 36.8%、20.0%、17.7%和 14.8%.5 L发酵罐进行高密度发酵,诱导 72 h后,TPRK的酶活达到 77 471.99 U/mL.在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落,起到剥鳞效果,并且最适水解条件为:TPRK添加量为 300 U/mL、反应温度 55℃、pH 9.0 和反应时间 2 h.[结论]过表达分子伴侣Ssa1 能够有效提升TPRK的表达量,利用该TPRK处理羊毛纤维,可有效去除羊毛鳞片层,而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小.

[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

利用异源重组表达系统表达外源蛋白是基因工程研究的重点.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲基营养型酵母,由于其易于遗传操作、高水平分泌外源蛋白、翻译后修饰等特点,已成为工业应用中蛋白质生产的重要菌株,常被用于酶制剂的生产.然而,部分外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达水平较低,仍有待提升的空间.因此,进一步探索提升毕赤酵母中外源蛋白表达量的原理和方法,将对降低毕赤酵母表达系统工业化生产成本,提高经济效益,具有重要的意义.本文主要从基因水平、转录水平、翻译水平、折叠分泌水平、抗逆水平、发酵工艺六个方面归纳总结了近年来毕赤酵母提高外源蛋白表达的优化策略的研究进展,旨在为提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达水平提供有益参考.

[目的]在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中建立一套分子靶向突变系统,为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具.[方法]基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9)技术,设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE),并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能.电转化酵母后,利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式,并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列(即spacer)长度等因素对CBE功能的影响.[结果]nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑.当连接肽长度为(GGGGS)1o时,CBE的编辑效率最高,编辑窗口位于前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)远端的C20-C14之间,其中C18的编辑效率可达85.1％.nCas9与PmCDA 1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大.而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率,且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt,但19-23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑.[结论]本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了 一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器,为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持.

蜕皮是许多变态发育昆虫的一种重要生理现象,昆虫通过蜕皮液中的酶对新旧表皮进行分离.已有相关蛋白组学的研究证明,家蚕蜕皮液中具有一种含量丰富的羧肽酶 A(Bombyx mori-carboxypeptidase A,Bm-CPA),目前对其作用功能尚不清楚.为了更好地了解Bm-CPA在家蚕蜕皮发育过程的作用,本研究通过生物信息学分析、实时荧光定量 PCR、抗体制备、免疫荧光染色和毕赤酵母表达等方法对Bm-CPA进行了研究.结果显示,Bm-CPA具有保守的M14 锌羧肽酶结构域和糖基化位点,并且受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)调控,在眠期和上簇期的表皮中大量表达;免疫荧光染色显示 Bm-CPA 在眠期的表皮中富集,Bm-CPA 抑制剂会导致幼虫因无法蜕皮而死亡;通过毕赤酵母表达系统在体外成功获得大量的重组 Bm-CPA 蛋白.这些结果为深入了解家蚕蜕皮发育过程提供了一定的参考.

目的 对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考.方法 将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性.结果 目标蛋白wtRBD和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d间隔时间的IgG抗体滴度增加了 1.8倍(44 923 vs.80 507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2 191 vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了 32 255(2 167～88 084);在采用5μg或30 μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5 μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考.

从骆驼科动物血清中提取的纳米抗体,由于其具有不同于传统单克隆抗体的结构和较小的尺寸,以及高特异性、高理化稳定性和组织渗透性等特征,因此显示出巨大的应用潜力,被认为是生物医学发展中有前景的治疗性蛋白.利用微生物生产表达纳米抗体无须翻译后修饰,可实现大规模生产,且显著降低生产成本.目前常规生产纳米抗体的表达系统主要为大肠杆菌、毕赤酵母和哺乳动物细胞系,此外还有真菌、植物细胞、昆虫细胞及乳酸杆菌等表达系统.详细介绍了不同表达系统的特点、优势及应用,并总结了各个系统亟须解决的问题,同时概述了治疗性纳米抗体药物的生产、研发情况及临床疾病治疗应用,以期为选择合适的表达系统,用于治疗性纳米抗体的生产及临床治疗提供参考依据.

目前,生物界成功分离750种抗菌肽,其中具有抗肿瘤活性的约占13.1%,源于两栖动物和鱼类分别约占13.3%和9.3%.鱼类和两栖动物抗菌肽均属最原始脊椎动物,后天免疫系统极为脆弱,大部分依靠鳃、皮肤和肠道呼吸,主要依靠强大的先天固有免疫系统来避免病原菌侵染,因此分布在不同部位的抗菌肽便成了这类低等生物形成广谱防御第一道防线的重要组成成分.综述了具有广谱抗菌活性和免疫调节能力的moronecidin、epinecidin-1、paradaxin、misgurin这几种分布在杂交条纹鲈鱼、条带石斑鱼、豹鳎鱼和泥鳅的抗菌肽及臭蛙抗菌肽抗菌谱,如moronecidin可杀死所有的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌;epinecidin-1可有效预防石斑鱼感染嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)并杀死神经坏死病毒;paradaxin具有抗肿瘤活性;misgurin杀菌能力极强,臭蛙抗菌肽能杀死白色念珠菌,总结了在毕赤酵母中成功表达的抗菌肽和源于鱼类和两栖动物中具有抗病毒和抗肿瘤活性的抗菌肽,探讨了这几种抗菌肽应用时存在的问题及解决方案,旨在为绿色、有效的抗菌肽药物在各个领域发挥巨大潜力提供理论依据.

为了提高黄曲霉毒素 B1(aflatoxin B1,AFB1)单链抗体(single chain Fv fragment, scFv)的表达量和生物活性,将从杂交瘤细胞株2C10中反转录后经基因拼接技术获得的scFv片段基因分别构建到E.coli表达载体pET-30a中和酵母表达载体pPICZαA中进行比较.重组质粒pET-30a-pelB-scFv构建好后转化到BL21(DE3)中进行IPTG诱导蛋白表达,重组质粒pPICZαA-scFv构建完成经线性化后,经电转化法转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导蛋白表达.表达蛋白经镍离子亲和层析法进行纯化,后检测其生物学活性.结果显示抗AFB1scFv获得了高效表达,在大肠表达系统和酵母表达系统中表达量分别是34 mg/L 和132 mg/L,目的蛋白大小为29 ku左右.纯化后的蛋白经SDS-PAGE,Western blot和ELISA对其进行性质分析,得知抗 AFB1 scFv蛋白具有很好的生物学活性,且灵敏度分别为40 μg/mL 和35 μg/mL.酵母表达系统与E.coli BL21(DE3) 表达系统相比,虽然scFv灵敏度转好,但仍有较大提升空间.