通过分析不同生长年限、不同采收月份、不同部位的两面针栽培品主要药效成分含量的变化规律,并与野生品比较,确定两面针的最佳采收期和合理药用部位.采用高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为Kinetex C18(4.6 mm×100 mm,2.6 μm),流动相为 0.2%三乙胺的 0.3%磷酸水溶液-乙腈(80∶20),流速 1.0 mL·min-1,检测波长 273 nm,柱温 30℃,以主要药效成分氯化两面针碱和白屈菜红碱为指标,对两面针样品进行含量测定.结果表明野生与栽培两面针根的主要药效成分含量无显著性差异,栽培两面针根与根+茎无显著性差异;由层次聚类分析(HCA)与主成分分析(PCA)结果说明两面针根与茎能明显区分,但无法区分野生与栽培品,与显著性分析结果一致;1～6 年两面针根的氯化两面针碱和白屈菜红碱质量分数之和为0.114%～0.256%,茎 0.030%～0.133%,主要药效成分含量与生长年限呈正相关;4 个季节采样均无显著性差异,说明采收季节对两面针主要药效成分含量无影响;3 个种植基地的两面针(不含枝)以干燥品计算氯化两面针碱和白屈菜红碱含量之和,云浮为 0.308%±0.123%,茂名为 0.192%±0.025%,南宁为 0.197%±0.052%,3 个种植基地均≥0.15%,即移栽 2 年 6 个月以上的两面针同时以根(含须根、主根和地下茎)和茎(地上茎)入药可满足要求.综上,两面针栽培品可以作为两面针野生品的合理替代,为实现两面针资源的可持续开发与应用提供保障;根与茎均可作为两面针的药用部位,建议《中国药典》两面针的药用部位修订为干燥根和茎,全年均可采挖.为保障有效成分含量及临床有效性,建议采收移栽3年以上的两面针根和茎入药.

目的 探究氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)对宫颈癌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 以宫颈癌细胞系HeLa及SiHa为对象,通过CCK-8法和克隆形成实验检测NC的细胞毒性作用及对细胞生长的抑制作用.通过TUNEL法检测NC对宫颈癌细胞凋亡的影响,并采用West-ern blot法检测凋亡相关蛋白表达情况.运用免疫共沉淀实验、泛素化实验及Western blot实验分析NC对宫颈癌细胞中p53与E6AP蛋白相互作用、p53泛素化修饰水平、p53蛋白稳定性的影响.结果 NC可明显抑制宫颈癌细胞增殖、诱导宫颈癌细胞凋亡,可抑制宫颈癌细胞中抑癌蛋白p53与泛素蛋白连接酶E6AP相互作用,降低p53泛素化修饰水平,延缓p53降解,增加p53蛋白表达水平.结论 NC可通过抑制p53泛素化降解,提升p53蛋白表达水平,恢复其抑癌功能,发挥抗宫颈癌作用.

溃疡性结肠炎(UC)是以结肠上皮屏障的受损及免疫稳态的破坏为特征的慢性非特异性炎症疾病,病程冗长、迁延不愈、复发率高,是公认的难治性消化性疾病.微小RNA(miRNA)已被证实在UC患者和UC动物模型中均存在特异性或差异性表达,可作为UC诊断的标志物或治疗的参考.因中药治疗UC疗效确切、作用广泛、副作用小,故本文以miRNA为切入点,系统阐述中药通过调控miRNA的表达进而调节UC相关信号通路的作用机制.结果发现,绿原酸、安肠汤、扶阳活血解毒方可通过调控miR-155、miR-146a、miR-31-5p等的表达,进而抑制信号转导及转录激活蛋白(STAT)信号通路转导来改善UC;柠檬苦素、人参皂苷Rh2、青蒿琥酯等可通过调控miR-214、miR-155、miR-19a等的表达,进而抑制核因子κB(NF-κB)信号通路转导来改善UC;氯化两面针碱、小檗碱、白藜芦醇等可通过调控miR-31、miR-146a、miR-146b等的表达,进而抑制Toll样受体4(TLR4)信号通路转导来改善UC;芒果多酚、复方芩柏颗粒、黄芪多糖可通过调控miR-126、miR-193a-3p的表达,进而抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路转导来改善UC.

目的 优选龙钻通痹方(LTR)总生物碱的最佳纯化工艺.方法 采用5种型号的大孔树脂对LTR总生物碱进行吸附与解吸,以总生物碱的吸附量、吸附率和解吸率为指标,筛选出较佳大孔树脂;然后通过单因素考察和星点设计-效应面法优选LTR总生物碱的最佳纯化工艺参数.结果 HPD100树脂纯化龙钻总生物碱的最佳工艺条件为pH值1.7的生药质量浓度0.17 g/mL,以1mL/min体积流量上样,9倍柱体积80％乙醇以1mL/min洗脱.在该条件下,LTR总生物碱提取物中总生物碱的质量分数达到了22.23％,产品得率为173.27 mg/g.结论 HPD100型大孔树脂能较好地用于分离纯化LTR总生物碱,为进一步的药效学研究提供依据.

目的:研究氯化两面针碱和芝麻素单一和联合作用时对斑马鱼胚胎发育的表现影响.方法:采用半静态实验法,单一作用时,氯化两面针碱设置5个含药浓度组(4 μg/ml,5.25μg/nl,6.92 μg/ml,9.12μg/ml及12μg/ml);联合作用时,选取氯化两面针碱∶芝麻素=5∶4(联用Ⅰ),5∶1(联用Ⅱ),1∶5(联用Ⅲ)3个试验组,其中氯化两面针碱的浓度与单一用药时5个浓度一致.结果:单一用药时氯化两面针碱72hpf的半数致死浓度(LC50)为12.27μg/ml,96hpf时为7.57μg/ml,芝麻素在实验浓度范围内未显示出毒性作用;联合作用时,3个实验组的毒性作用均小于氯化两面针碱单一作用时.综合结果显示,3个联合用药组之间对斑马鱼胚胎的毒性作用不具有统计学差异.结论:氯化两面针碱和芝麻素联合作用时比氯化两面针碱单一作用时对斑马鱼胚胎发育的毒性明显为小.

目的:初步探讨氯化两面针碱(NC)对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响及其机制.方法:将HT29细胞分为溶剂对照组、15 μmol/L NC组、30μmol/L NC组和60 μmol/L NC组,采用CCK-8法检测NC对细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡,western blotting法检测细胞色素c(Cyt-c)和caspase-3蛋白的表达水平.结果:与对照组相比,各NC实验组的细胞存活率显著降低,凋亡率显著升高,15 μmol/L NC组、30 μmol/L NC组和60 μmol/L NC组细胞凋亡率分别为(35.30±14.30)％、(41.48±17.89)％和(46.51±11.35)％,差异具有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,不同浓度NC组Cyt-c和caspase-3蛋白表达明显上调(P＜0.05).结论:NC能够显著抑制人结肠癌HT29细胞的增殖,诱导HT29细胞凋亡,其分子机制可能与Cyt-c介导的线粒体凋亡途径有关.

目的 探讨氯化两面针碱(NC)通过MAPK信号通路调控乳腺癌及肝癌细胞转移的机制.方法 人乳腺癌细胞MDA-MB-231及肝癌HepG2细胞给予不同浓度的NC处理,利用MTS法检测细胞增殖能力;利用Wound-healing及Matrigelbased transwell invasion实验检测细胞迁移、侵袭能力;利用荧光定量PCR及Western blot方法检测肿瘤转移相关蛋白的表达情况及MAPK信号通路活性.结果 与对照组相比,NC处理后MDA-MB-231及HepG2细胞增殖能力明显受到抑制,且增殖抑铽率随着NC浓度的增加逐渐明显(P＜0.05).NC处理后细胞迁移及侵袭能力明显降低(P＜0.05);基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达量均明显降低(P＜0.05);p-ERK1/2、p-JNK、p-p38表达量明显降低(P＜0.05),而t-ERK1/2、t-JNK、t-p38表达量变化不明显(P＞0.05).结论 NC通过MAPK信号通路,抑制乳腺癌及肝癌细胞转移,为临床用药提供有价值的实验资料.

目的 观察氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用,并探讨其可能作用机制.方法 将大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病模型组(DN)、氯化两面针碱(NC)20和40 mg/kg干预组.在建模成功后灌胃氯化两面针碱,1次/d,一共给药7周.试剂盒检测血清中的胰岛素与胰高血糖素;过碘酸希夫(PAS)染色法观察肾脏组织病理形态学;原位末端标记法检测肾小球细胞凋亡;免疫印迹法检测肾组织中磷酸化Smad2与Smad3表达水平、TGF-β1与Smad7蛋白表达水平.结果 DN组大鼠的胰岛素含量低于对照组(P<0.05),胰高血糖素含量高于对照组(P<0.05);给予氯化两面针碱干预后,大鼠血清中的胰岛素含量增加,胰高血糖素含量下降;低剂量组肾脏的PAS染色呈弱阳性,可见弥漫性肾小球硬化,药物高剂量组无基底膜增厚及肾小管病变;肾组织中磷酸化Smad2与Smad3表达降低(P<0.05),TGF-β1与Smad7蛋白表达降低(P<0.05).结论 氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠肾脏具有一定程度的保护作用,其可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路发挥作用.

两面针是我国民间常用的传统中药之一,从根部提取分离到的氯化两面针碱是两面针植物多种生物活性的主要有效成分.当前,直接从植物中提取分离有效成分的方法不仅回收率低、成本高,而且氯化两面针碱存在水溶性差和生物利用度低的问题,因此大多学者致力于改造其结构以提高活性和利用度,同时探索高效经济的全合成方法以满足研究和生产的需求.该文以国内外相关文献为基础,对氯化两面针碱的提取、分离纯化、结构化合物的全合成路线以及药理活性机制的研究进展做一综述,总结目前研究中存在的不足,并对今后的研究重点做出展望,旨在为今后深入研究两面针碱及衍生物活性改造、解析作用机制、开发基于此结构的创新药物分子等提供理论依据.

目的:建立HPLC同时测定八味龙钻颗粒中橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素含量的方法.方法:采用高效液相色谱法.色谱柱Phenomenex Gemini C18 (250 mm×4.6mm,5 μm);流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(梯度洗脱);流速为1mL·min-1;检测波长为286 nm和245 nm(0～30 min,286 nm,30～40 min:245 nm).结果:橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素分别在0.081 30～0.487 8,0.016 57～0.099 42,0.005 284～0.031 68mg·mL-1范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系(相关函数r分别为0.997 4,0.999 9,1.000);平均加样回收率分别为98.1％、99.9％、100.1％,RSD分别为1.3％、2.7％、2.5％(n=6).结论:该法简单快速、准确可靠,可用于同时测定该复方制剂中橙皮苷、氯化两面针碱及补骨脂素的含量.