目的:探讨CXCR4特异性拮抗剂AMD3100影响癫痫发作的分子机制。方法:(1)动物实验：36只成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、癫痫组和AMD3100处理组，每组12只。癫痫组大鼠腹腔注射戊四氮(PTZ)构建癫痫模型，剂量为40 mg/kg；AMD3100处理组大鼠侧脑室注射5 μL(5 mg/mL) AMD3100 20 min后腹腔注射同等剂量PTZ；对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。采用Racine分级评估各组大鼠癫痫发作等级并记录其癫痫发作潜伏期，采用脑电图(EEG)记录各组大鼠脑神经元异常放电情况，采用ELISA试剂盒检测各组大鼠海马组织 γ-氨基丁酸(GABA)含量。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测各组大鼠海马组织神经元γ-氨基丁酸A受体α1亚单位( GABAAR α1) mRNA水平。(2)细胞实验：另取SD大鼠鼠婴(1日龄)培养原代海马神经元，培养7 d后将细胞分为对照组、癫痫组和AMD3100处理组。癫痫组神经元采用无镁外液诱导的方法构建癫痫细胞模型；AMD3100处理组神经元在含有10 nmol/L AMD3100的无镁外液中培养3 h，随后换为Neurobasal继续培养；对照组采用Neurobasal培养基常规培养。采用全细胞膜片钳技术检测各组神经元灌流AMD3100(10 nmol/L)后自发性抑制性突触后电流(sIPSC)。 结果:(1)动物实验：AMD3100处理组大鼠发作潜伏期较癫痫组大鼠明显缩短[分别为(663.30±74.84) s、(164.40±17.20) s]，差异有统计学意义( t=6.490， P<0.001)；AMD3100处理组大鼠4级以上发作次数较癫痫组大鼠明显减少[分别为(3.75±0.39)次、(9.00±0.73)次]，差异有统计学意义( t=4.680， P<0.001)。ELISA实验结果显示，3组大鼠GABA含量差异有统计学意义( F=17.850， P<0.001)，其中癫痫组明显低于对照组，AMD3100处理组大鼠明显高于癫痫组，差异均有统计学意义( P<0.05)。qRT-PCR实验结果显示，3组大鼠 GABAAR α1 mRNA含量差异有统计学意义( F=14.400， P<0.001)，其中癫痫组明显低于对照组，AMD3100处理组大鼠明显高于癫痫组，差异均有统计学意义( P<0.05)。EEG结果显示，与癫痫组大鼠比较，AMD3100处理组大鼠放电频率有所降低。3组大鼠EEG功率差异无统计学意义( F=3.220， P=0.062)，但与癫痫组、对照组大鼠比较，AMD3100处理组大鼠EEG功率有所降低。(2)细胞实验：膜片钳技术检测结果显示，3组神经元sIPSCs的频率和波幅差异均有统计学意义( F=13.670， P<0.001； F=10.920， P<0.001)。与对照组、癫痫组比较，AMD3100处理组神经元sIPSCs的频率和波幅均显著增加，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:CXCR4拮抗剂AMD3100可通过增强抑制性神经传递降低癫痫发作频率。

目的:探讨艾司洛尔对人诱导多能干细胞来源心肌细胞(hiPSC-CM)自发动作电位的影响。方法:选择培养60 d的hiPSC-CM，提取单个心肌细胞，应用膜片钳技术建立全细胞记录模式。采用动作电位细胞外液或起搏电流细胞外液将艾司洛尔稀释至100 μmol/L，灌流速度3 ml/min，灌流量10 ml。分别于给药前(T 0)、给药后5 min(T 1)和冲洗后5 min(T 2)时记录自发动作电位的频率、静息电位、阈电位、振幅、90%复极时间、超极化电位、超极化后复极时间和起搏电流。 结果:与T 0时比较，T 1时hiPSC-CM自发动作电位的频率升高，振幅和超极化电位降低，90%复极时间和超极化后复极时间缩短( P<0.05)，hiPSC-CM起搏电流-钳制电压曲线无明显移位( P>0.05)。与T 1时比较，T 2时hiPSC-CM自发动作电位的频率降低，振幅和超极化电位升高，90%复极时间和超极化后复极时间延长( P<0.05)，hiPSC-CM起搏电流-钳制电压曲线无明显移位( P>0.05)。不同时点hiPSC-CM自发动作电位的静息电位和阈电位比较差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:艾司洛尔可增加hiPSC-CM的自发动作电位节律，其机制可能与起搏电流无关。

目的:构建微流控器官芯片，并评估其在模拟骨关节炎进程中软骨下骨骨重塑的能力。方法:基于微流控技术和细胞共培养技术设计芯片主体，MC3T3-E1细胞贴壁培养在细胞接种小室的内部，在细胞接种小室的底部以0.5 ml/min的流速灌流培养基。评价指标：（1）微流控器官芯片的评价：灌流生长培养基，采用模拟仿真实验测试不同时间点细胞接种小室内部和底部液体的浓度差和平衡时间；活死染色观察细胞在设定流速下连续培养3、7 d的生物相容性，分为3 d组和7 d组。（2）微流控器官芯片的促成骨作用：灌流成骨诱导培养基，通过碱性磷酸酶（ALP）染色和PCR比较细胞在静态和灌流条件下3、7 d的黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因成骨特异性转录因子2（RUNX2）、Ⅰ型胶原（COL1A1）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、骨钙素（OCN）的表达情况，分为静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组。（3）三种成骨细胞亚型外泌体（EVs）的形态和大小表征及生物相容性：获取三种不同细胞亚型［内皮型成骨细胞（EnOB）-EVs、基质型成骨细胞（StOB）-EVs和矿化型成骨细胞（MinOB）-EVs］，通过透射电镜和粒径分析获取形态和大小；灌流含有三种不同细胞亚型EVs的生长培养基，通过细胞增殖/凋亡检测实验比较添加不同EVs浓度（1、1.25、2.5、5 μg/ml）24 h的生物相容性，分为EnOB-EVs组、StOB-EVs组、MinOB-EVs组。（4）三种成骨细胞亚型EVs的促成骨作用：灌流含有三种不同细胞亚型EVs的成骨诱导培养基3 d，通过ALP染色和PCR比较黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN的表达情况，分为无EVs组、EnOB-EVs组、StOB-EVs组和MinOB-EVs组。结果:（1）微流控器官芯片的评价：模拟仿真结果显示，在持续灌流12 h后，上室最上层浓度达到下室浓度的95%以上，最下层为下室浓度的96.5%左右，上下室的浓度差达到平衡状态。活死染色结果表明，芯片在0.5 ml/min的流速下，生物相容性好，灌流3、7 d细胞存活率分别为（99.48±0.12）%、（97.07±1.05）%（ P<0.01）。（2）ALP染色结果显示，3 d时灌流诱导组黑色ALP阳性细胞最多，静态诱导组其次，静态未诱导组最少；7 d时静态诱导组黑色ALP阳性细胞最多，灌流诱导组其次，静态未诱导组最少。PCR结果显示，3 d时静态未诱导组RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.03、1.00±0.12、1.00±0.01、1.00±0.02，静态诱导组分别为1.80±0.04、4.05±0.37、9.80±1.94、4.38±0.89，灌流诱导组分别为2.45±0.23、5.48±0.42、91.50±4.56、10.82±4.96（ P<0.01）。7 d时静态未诱导组RUNX2表达水平为1.00±0.01，静态诱导组为1.46±0.46，灌流诱导组为1.11±0.08（ P>0.05）；静态未诱导组COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.03、1.00±0.13、1.00±0.09，静态诱导组分别为9.38±0.25、14.27±4.35、84.01±4.02，灌流诱导组分别为2.39±0.08、133.64±8.87、86.64±8.36（ P<0.01）。3、7 d时静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组相互比较，均为灌流诱导组的促成骨能力最强。（3）三种成骨细胞亚型EVs的形态和大小表征及生物相容性：透射电镜下EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs均为典型的茶托状形态。粒径分析结果显示，EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的大小分别为（91.3±14.7）nm、（106.0±16.0）nm、（68.1±10.7）nm。细胞增殖/凋亡检测结果显示，EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的最佳给药浓度均为1.25 μg/ml。（4）微流控器官芯片对于三种EVs促成骨功能验证：ALP染色结果显示，无EVs组黑色ALP阳性细胞最少，添加EnOB-EVs组其次，StOB-EVs组再者，MinOB-EVs组最多。PCR结果显示，无EVs组RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.01、1.00±0.03、1.00±0.02、1.00±0.02，EnOB-EVs组分别为1.95±0.11、6.78±2.04、7.99±0.57、6.93±3.83，StOB-EVs组分别为0.79±0.12、5.68±1.53、12.59±3.15、25.59±0.95，MinOB-EVs组分别为0.68±0.10、4.36±0.69、18.75±3.21、34.74±3.98（ P<0.01）。无EVs组、EnOB-EVs组、StOB-EVs组和MinOB-EVs组相互比较，MinOB-EVs组促成骨效果最明显。 结论:基于微流控技术和细胞共培养技术所构建的微流控器官芯片能够维持MC3T3-E1细胞的正常生长、促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨诱导分化能力。不同时期的成骨细胞所释放的EVs具有促成骨作用，加速骨关节炎进程中软骨下骨骨重塑中骨硬化的现象。

目的 建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础.方法 应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20g/L,培养温度36～38 ℃,DO 20％～60％,pH 7.0～7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测.结果 30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×107个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225～2.173,P=0.096～0.833).2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374).2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致.结论 可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准.

由于各种疾病在全球范围内的肆虐,国际市场对重组腺病毒载体(adenoviral vector,Adv)疫苗的需求量急剧增加,而工艺研究是解决这一问题的有效手段之一.在细胞接毒前施加高渗胁迫可以提高分批培养模式下的Adv产量,新兴的灌流培养也可以显著提高Adv的产量.将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合,有望进一步提升高细胞密度生产过程中的Adv产量.本研究利用摇瓶结合拟灌流培养作为生物反应器灌流培养的缩小模型,使用渗透压为 300?405 mOsm的培养基研究了高渗胁迫对细胞生长和 Adv 生产的影响.结果显示,在细胞生长阶段使用 370 mOsm 的高渗透压培养基,在病毒生产阶段使用 300 mOsm的等渗透压培养基的灌流培养工艺有效地提高了Adv的产量.进一步研究发现这可能归因于病毒复制后期 HSP70 蛋白的表达量增加.将这种工艺放大至生物反应器中,Adv的产量达到3.2×1010 IFU/mL,是传统灌流培养工艺的3倍.本研究首次将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合的策略应用于HEK 293细胞生产Adv,同时揭示了高渗胁迫工艺增产Adv的可能原因,为HEK 293 细胞生产其他类型Adv的工艺优化提供了借鉴.

目的 研究铅(Pb2+)对大鼠皮质神经元γ-氨基丁酸(GABA)A型受体介导电流(IGABA)及GABA能突触传递的抑制作用及其机制.方法 ①分离出生0d的SD大鼠大脑皮质神经元进行原代培养,培养7～14 d用膜片钳系统记录神经元GABA激活的IGABA,检测不同浓度Pb2+(1,5,10,50和100 μmol·L-1)(Y管给药,作用时间20s)对GABA(100 μmol·L-1)激活IGABA的影响,并检测Pb2+ 50 μmol·L-1(Y管给药,作用时间20s)对不同浓度GABA(1,10,50,100,500和1000 μmol·L-1)激活IGABA的影响.②取15～19 d日龄雄性SD大鼠大脑制作厚度为350 μm的脑片样本,记录自发抑制性突触后电流(sIPSC)、微小抑制性突触后电流(mIPSC)和注入电流诱导的动作电位(AP),检测Pb2+ 10 μmol·L-1(灌流速度2 mL·min-1)处理前和处理5 min后sIPSC和mIPSC振幅和频率及AP频率.结果 ①在10,50和100 μmol·L-1浓度时,随浓度升高,Pb2+抑制原代培养神经元IGABA的作用增强,IC50值为(68±20)μmol·L-1.②Pb2+ 50 μmol·L-1抑制GABA最大激活电流(P<0.01),升高GABA的EC50值,由无Pb2+组的(20±6)μmol·L-1增加到(87±39)μmol·L-1,表明Pb2+可能以非竞争性机制抑制IGABA.③脑片实验中,与处理前比较,Pb2+10 μmol·L-1处理5 min后可逆地抑制神经元sIPSC的频率(P<0.01)而未影响其振幅,而mIPSC的频率和振幅均未受到影响.此外,Pb2+ 10 μmol·L-1抑制AP的频率(P<0.01),降低神经元的整体兴奋性.结论 Pb2+对原代培养神经元IGABA有明显的抑制作用;Pb2+可能通过抑制皮质神经元的AP抑制sIPSC的频率;提示Pb2+对原代培养神经元IGABA的抑制以及对脑片神经元sIPSC频率的抑制可能存在不同的机制,反映了Pb2+中毒机制的复杂性.

[目的]探讨miR-21 抑制剂antagomiR-21 调控沉默信息调节因子1(SIRT1)对2 型糖尿病(T2DM)大鼠冠状动脉内皮依赖性舒张的影响及其机制.[方法]以腹腔注射链脲佐菌素加高脂饲料喂养的方法建立T2DM 大鼠模型,将28 只成模大鼠随机分为模型组、antagomiR-NC组、antagomiR-21 组、antagomiR-21+SIRT1 抑制剂EX527 组,每组7 只;另将7 只普通饲料喂养的正常大鼠作为对照组.观察大鼠冠状动脉血流变化,采用离体血管环灌流技术观察大鼠冠状动脉的舒张功能.将体外培养的人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)分为甘露醇组、高糖组、高糖+antagomiR-NC组、高糖+antagomiR-21 组、高糖+antagomiR-21+EX527 组,采用qRT-PCR检测miR-21、SIRT1 的mRNA表达,Western blot检测SIRT1、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及其磷酸化蛋白的表达.[结果]与对照组相比,T2DM模型大鼠冠状动脉中miR-21 水平升高96.88％,而SIRT1蛋白和mRNA 水平、冠状动脉流量分别降低40.85％、64.29％、22.15％(P＜0.05);与甘露醇组比较,体外高糖处理的HCAEC 中miR-21 表达升高285.71％,SIRT1 蛋白和mRNA表达水平分别降低44.78％、74.51％(P＜0.05);an-tagomiR-21 干预后体内外miR-21 水平分别降低77.42％、58.66％,SIRT1 蛋白水平分别升高55.56％、91.43％,SIRT1 mRNA 水平分别升高88.57％、97.30％(P＜0.05);与模型组相比,antagomiR-21 干预后大鼠冠状动脉流量升高19.23％,10-8 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L及10-5mol/L 乙酰胆碱(Ach)诱导的大鼠冠状动脉舒张率分别升高111.89％、41.88％、41.98％、30.01％(P＜0.05),10-8 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L 及10-5mol/L 去氧肾上腺素(Phe)诱导的大鼠冠状动脉收缩率分别降低36.71％、47.90％、49.19％、45.27％(P＜0.05);antagomiR-21 干预后HCAEC 中PI3K、Akt、eNOS的磷酸化水平较高糖组分别升高48.48％、81.40％、134.29％(P＜0.05);EX527 处理可明显逆转体内外antagomiR-21 引起的上述变化(P＜0.05).[结论]antagomiR-21 可通过上调SIRT1 表达激活PI3K/Akt/eNOS信号通路,从而改善T2DM 大鼠冠状动脉内皮依赖性舒张.

目的 观察乙醇对体外培养枯否细胞(KCs)吞噬功能、微丝表达和膜流动性影响.方法 经门静脉插管胶原酶灌流消化肝脏,密度梯度离心分离KCs;体外培养KCs中加入不同剂量乙醇(1、2、4g/L)作用3、24 h,采用聚苯乙烯乳珠吞噬实验、荧光染色法和荧光光度法检测KCs的吞噬功能、微丝表达、肌动蛋白含量及膜流动性.结果 1、2、4g/L乙醇组作用3、24 h KCs吞噬聚苯乙烯乳珠数量分别为(16.05 ±3.69)、(15.86±4.50)、(13.86 ±4.69)和(13.95±4.51)、(14.35±6.52)、(9.71±3.34)个,明显低于对照组[分别为(20.13 ±5.26)、(20.30 ±8.57)个](P＜0.05);4g/L乙醇组(作用24 h)KCs吞噬功能明显低于1、2 g/L乙醇组(P＜0.05);各剂量乙醇组(作用3h)KCs微丝排列紊乱,但肌动蛋白含量无明显变化;与对照组(5.85±1.13)比较,2、4g/L乙醇组KCs膜流动性[(2.30±1.08)、(1.62±0.30)]明显降低(P＜0.05),呈剂量依赖性.结论 乙醇可降低体外KCs的吞噬功能,其机制可能与乙醇致KCs膜流动性下降和微丝排列紊乱有关.

目的 探讨原代培养的小鼠气管单层细胞培养方法 及流感病毒对原代培养的小鼠气管单层细胞囊性纤维化跨膜转导调节因子的影响,明确流感病毒破坏呼吸系统水盐转运平衡的影响机制.方法 应用倒置显微镜记录细胞形态,应用电阻计测量跨上皮电阻以评估细胞间的紧密连接状态,尤斯灌流装置记录原代培养的小鼠气管单层细胞短路电流.结果 200倍焦距的光镜下培养的原代小鼠气管上皮细胞形态呈紧密连接的铺路石状,跨上皮电阻在培养6 d后大于1000Ω;在细胞膜完整的条件下,流感病毒能降低囊性纤维化跨膜转导调节因子短路电流至(52.77±10.30)％,在基底膜通透的细胞单层中,流感病毒能降低囊性纤维化跨膜转导调节因子短路电流至(41.50±1.09)％,而囊性纤维跨膜转导调节因子在调节呼吸道水盐转运平衡中有重要作用.结论 气液交界面模式培养小鼠气管上皮细胞非常高效,并且接近小鼠正常的生理状态;流感病毒可能通过抑制囊性纤维化跨膜转导调节因子的功能,阻滞阴离子分泌,进而诱发慢性阻塞性肺病以及哮喘等肺部相关性疾病.

目的 研究应用固定床式生物反应器制备慢病毒的工艺.方法 分别在2个1.5L固定床式生物反应器中,加入50 g片状载体,接种293T细胞,当细胞生长3d,细胞密度达1.0～1.5×107个/mL时,使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为转染介质转染质粒制备慢病毒;分别根据葡萄糖消耗进行换液培养收获和连续灌流收获病毒原液,采用逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度.结果 换液培养共收获6L慢病毒原液,收获时间持续5d,病毒滴度最高可达5.13×107 TU/mL;连续灌流培养共收获9L慢病毒原液,收获时间持续8d,病毒滴度最高可达2.62×108 TU/mL.结论 用固定床式生物反应器连续灌流培养可用于临床级别的慢病毒制备.