灵芝被广泛应用于食品(保健)、药品和化妆品等领域.灵芝酸A是一种具有重要药理活性的灵芝三萜类化合物.现代药理研究表明,灵芝酸A具有抗肿瘤、抗神经精神系统疾病、肝保护作用、降血脂作用、抗炎和肾保护作用等多种药理作用.本文对灵芝酸A的药理学作用及其机制研究新进展进行梳理与总结,为其进一步开发和应用提供参考.

目的:探讨灵芝三萜联合外源性单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialotetrahexosyl ganglioside，GM1)对戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)致痫大鼠认知功能及海马神经元突触超微结构的影响。方法:将40只雄性清洁级SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、癫痫模型组、灵芝三萜组、GM1组、灵芝三萜联合GM1组，每组8只。采用腹腔注射亚惊厥剂量PTZ( 35 mg·kg -1·d -1)的方法建立慢性癫痫大鼠模型，1次/d，连续28 d；用药各组大鼠在每日腹腔注射PTZ的同时按分组给予相应药物( GM1：腹腔注射30 mg·kg -1·d -1，灵芝三萜：灌胃1 000 mg·kg -1·d -1)。应用Morris水迷宫观测各组大鼠学习记忆能力；透射电镜观察海马神经元突触超微结构；免疫荧光染色法观察大鼠海马CA1区丝切蛋白(cofilin)、突触素(synaptophysin，SYN)的表达，同时用Western blot检测大鼠海马cofilin及其磷酸化p-cofilin和SYN的蛋白表达。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，组间多样本采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD检验。 结果:Morris水迷宫结果显示，各组间的逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间均差异有统计学意义( F＝5.259，8.240，5.961，均 P<0.05)。与癫痫模型组相比，灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组大鼠的逃避潜伏期[(20.31±7.39)s，(21.81±6.05)s，(17.66±4.76)s]均短(均 P<0.05)，穿越平台次数[(4.63±1.41)次，(4.50±1.93)次，(5.50±1.77)次]均多(均 P<0.05)，目标象限停留时间[(31.91±5.00)s，(30.49±5.72)s，(35.70±5.34)s]均长(均 P<0.05)，以灵芝三萜联合GM1组变化最明显( P<0.01)。透射电镜结果显示，各组海马神经元突触数量、突触间隙宽度、突触后致密物厚度、突触后膜活性区长度均差异有统计学意义( F＝3.693，7.201，5.012，4.033，均 P<0.05)。与癫痫模型组比较，灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组神经元突触数量[(8.00±1.79)个，(7.83±1.84)个，(8.50±1.87)个，]均多(均 P<0.05)，突触间隙[(33.83±3.81)nm，(32.43±4.14)nm，(30.23±3.08)nm]窄，突触后致密物质[(57.50±6.03)nm，(58.10±2.40)nm，(60.73±3.81)nm]均厚(均 P<0.05)。灵芝三萜组和灵芝三萜联合GM1组突触后膜活性区长度[(271.66±11.80)nm，(279.06±13.58)nm]均长于癫痫模型组(均 P<0.05)。免疫荧光结果显示，癫痫模型组cofilin平均荧光强度高于空白对照组，SYN平均荧光强度低于空白对照组( P<0.05)；GM1组和灵芝三萜联合GM1组cofilin平均荧光强度均低于癫痫模型组(均 P<0.05)，灵芝三萜联合GM1组SYN平均荧光强度高于癫痫模型组( P<0.05)。Western blot检测发现，癫痫模型组cofilin蛋白表达量高于空白对照组[(1.454±0.080)，(1.092±0.099)， P<0.05]，p-cofilin、SYN的表达量均低于空白对照组[(1.103±0.120)，(1.420±0.934)；(1.650±0.062)，(1.958±0.062)；均 P<0.05]；灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组大鼠海马组织内cofilin蛋白表达[(1.227±0.071)，(1.262±0.078)，(1.162±0.129)， P<0.05]均低于癫痫模型组，灵芝三萜联合GM1组p-cofilin、SYN蛋白表达[(1.357±0.199)，(1.873±0.010)， P<0.05]均高于癫痫模型组。与灵芝三萜组、GM1组比较，灵芝三萜联合GM1组各指标均差异无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:灵芝三萜联合GM1可改善神经元突触可塑性，提高癫痫大鼠学习记忆能力，部分指标优于单独用药。

目的 优化甘草汁制灵芝炮制工艺,评价炮制前后体外抗氧化、抗炎活性变化.方法 基于响应面法,运用层次分析法(AHP)和熵权法确定最佳炮制工艺;采用ABTS+、DPPH、羟自由基清除率的方法,评价多糖组分的抗氧化活性;采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α及NO的含量,评价三萜及甾醇组分的抗炎活性.结果 最佳炮制工艺为 1∶13 的甘草汁比例、4.4%的甘草用量以及 33 min的浸泡时间,炮制后总三萜及甾醇、水溶性浸出物的含量升高(P<0.01,P<0.05);炮制后的抗氧化活性增强(P<0.01);对炎症因子的抑制作用也优于生品.结论 所得炮制工艺稳定、可行;甘草汁制可促进灵芝成分溶出,协同其抗氧化、抗炎作用,且其抗炎活性的增强可能与麦角甾醇的溶出增加有关.

炎症是具有血管系统的活体组织对外源性和内源性损伤因子的刺激,所发生的以防御反应为主的基本病理过程,虽然自限性炎症可以促进致病因素的清除和受损组织的愈合,但持续性的炎症会损害发生炎症的器官甚至其他器官.近年来,中草药的抗炎作用成为新药研发的主要热点之一.灵芝酸属于灵芝三萜类化合物,是灵芝中主要的生物活性物质,其抗炎作用十分显著,可用于治疗癫痫、抑郁症、动脉粥样硬化、哮喘等炎症性疾病.本文基于现代医学研究及中医药传统理论,从调控NO及其合酶活性、调控细胞炎症因子和炎症信号通路、调控某些特定受体等方面出发,综述国内外灵芝酸抗炎作用机制的研究进展,以期为其深入研究及相关抗炎新药开发提供参考.

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap-HRMS)联用技术对灵芝醇提物的化学成分进行系统分析,总结其代表性化学成分的裂解规律,并对灵芝潜在作用于法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)靶点的抗肝纤维化活性物质进行研究,阐明其药效物质基础.初步鉴定出灵芝醇提物95种化学成分,包括灵芝酸类24种、灵芝烯酸类9种、赤芝酸类13种、丹芝酸类3种、灵芝内酯类1种、其他三萜类成分40种、脂肪酸类成分4种、其他类1种,并分析了其裂解规律.如灵芝酸、灵芝烯酸类成分的结构特征以C30为骨架,含有游离的-COOH及-OH,易失去H2O、CO2分子形成碎片离子,D环多为五元环,易发生断裂;赤芝酸类成分属于C27骨架的羊毛甾烷型,与灵芝酸类成分相比其侧链结构变短,由8个碳减少为5个,同灵芝酸类含有常见的游离-COOH、-OH,容易失去H2O、CO2分子.通过选取已报道的6种FXR受体激动剂组成训练集,建立基于FXR配体的药效团模型,以鉴定出的95种灵芝化学成分与药效团进行匹配,通过测试集分子对模型进行验证,选出最优药效团模型02(敏感性=0.750 00,特异性=0.555 56,ROC=0.750)用于对灵芝化合物库的虚拟筛选,经匹配筛选得到31种潜在的可用于激活FXR的灵芝活性成分,随后ADMET预测结果表明灵芝酸H和赤芝酸J与血浆蛋白的结合率低于90％,且无肝毒性,可作为FXR激活剂开发单用或联用治疗肝纤维化的临床药物.

近年来,灵芝产业高速发展,但其主要药效成分灵芝三萜的含量较低,是影响其品质的重要原因,因此探索一种提高灵芝三萜含量的生物技术手段极具应用前景.本研究以 6 株斜盖伞Clitopilus spp.真菌为材料分别制备多种类型的真菌诱导子,将其添加到灵芝菌丝体液体摇瓶中,研究对灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜积累的影响.其中,Clitopilus sp.HSL-YX-7-A 的高压灭菌发酵液(HSL FB)、C.hobsonii NL-19 的菌丝干粉(NL-19 DMP)、C.prunulus 84496 的发酵液提取物(84496 FBE)和Clitopilus sp.HSL-YX-7-A的菌丝提取物(HSL ME)显著提高了灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜含量,相对于对照组,生物量分别提高了 450.09%、64.64%、46.97%和 66.14%,灵芝三萜分别提高了 53.01%、25.58%、25.17%和 20.47%,灵芝三萜总产量则分别提高了 585.15%、104.65%、86.43%和110.45%.进一步研究表明,经HSL FB、NL-19 DMP和HSL ME处理后,灵芝三萜生物合成途径关键酶基因hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs和osc的表达量显著上调;但84496 FBE处理之后仅上调了hmgs和sqs的表达量.且6个基因的平均表达量与灵芝三萜总产量的提升率呈显著的正相关性(R2=0.972,P<0.05).本研究证实了斜盖伞诱导子能够有效提升灵芝菌丝体生物量和灵芝三萜含量,其中C.hobsonii NL-19 和Clitopilus sp.HSL-YX-7-A均为栎类树种的根系共生菌.本研究进一步为开发斜盖伞真菌作为微生物菌剂提供了基础,同时为提高栎树人工林的生产力和创建"以菌养菌"的药用真菌品质提升技术体系提供了重要策略.

通过代谢通量方法在 3 L搅拌式发酵罐上研究了油酸对灵芝液态深层发酵代谢终产物羊毛甾醇代谢流分布的影响.结果表明,在灵芝的液态深层发酵过程中,添加油酸使合成羊毛甾醇的代谢通量提高 45.29%;副产物麦角甾醇的含量由 3.84 mg/g降低至 0.02 mg/g;羊毛甾醇合成途径(LP)、三羧酸循环(TCA)、磷酸戊糖途径(PP)和糖酵解途径(EMP)的代谢通量比对照组分别提高了 29.09%、14.52%、12.22%和 2.11%.因此,添加油酸能够加强灵芝液态深层发酵过程中的整体代谢流分布,减少副产物麦角甾醇的积累,提高羊毛甾醇的代谢流量.该研究为下一步灵芝液态深层发酵中灵芝三萜得率的提高奠定研究基础.

采用中压层析、中高压层析、制备薄层等多种层析方法,对灵芝子实体的中等极性三萜组分进行分离纯化,得到 28 个化合物.依据核磁、质谱等波谱手段对化合物结构进行解析,分别鉴定为灵芝烯酸C(1)、3β,7β,12β-trihydroxy-11,15,23-trioxo-lanost-8,20-dien-26-oic acid(2)、灵芝酸C2(3)、赤芝酸N(4)、灵芝酸C6(5)、赤芝酮B(6)、灵芝酸G(7)、灵芝酸δ(8)、灵芝烯酸B(9)、灵芝酸B(10)、灵芝烯酸H(11)、灵芝烯酸K(12)、灵芝酸LM2(13)、灵芝酸AM1(14)、灵芝酸K(15)、灵芝烯酸A(16)、赤芝酸E2(17)、灵芝烯酸E(18)、灵芝酸Df(19)、灵芝酸H(20)、灵芝酸D1(21)、灵芝烯酸 D(22)、灵芝酸 A(23)、灵赤酸 D(24)、灵芝酸 D(25)、12β-acetoxy-7β-hydroxy-3,11,15,23-tetraoxo-5α-lanosta-8,20-dien-26-oic acid(26)、灵芝烯酸F(27)和灵芝酸 B 甲酯(28).该结果为灵芝子实体中含有的三萜种类调查提供了依据,也为后续的活性研究提供了较为充分的物质保障.

以灵芝子实体中 18 种主要三萜化合物为对照品,建立了灵芝三萜的高效液相定量检测方法.采用Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-水(0.01%乙酸)为流动相进行梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0 mL/min,检测波长254 nm.该方法实现了18种三萜化合物的基线分离,精密度、重复性、稳定性和加样回收率均符合方法学要求.将该方法应用于 2 个灵芝品种在不同栽培环境下的三萜含量评价中,结果发现,三萜的含量与品种、栽培环境都有很大的相关性,品种是影响灵芝子实体三萜含量的主要因素,但在不同环境下,同一品种的灵芝三萜含量也会发生变化.

灵芝孢子粉是灵芝的生殖细胞,包含灵芝所有的化学成分,主要含有灵芝三萜类、多糖类、甾体类、脂肪酸类和蛋白质类等多种化合物.灵芝孢子粉具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保护心血管、保肝护肝等药理作用.《中国药典》2020年版对灵芝孢子粉的质量控制标准尚未明确规定,就灵芝孢子粉化学成分和药理作用研究进展进行综述,并基于质量标志物(qualitymarker,Q-Marker)理论,从植物亲缘性与特有性、有效性、可测性、临床应用、可入血成分等方面进行Q-Marker预测分析,初步推测多糖类、灵芝酸、甾醇类(麦角甾醇)、不饱和脂肪酸(油酸)等成分为其Q-Marker,为规范灵芝孢子粉质量研究和建立、完善灵芝孢子粉质量标准提供参考.