基于蛋白组学探讨灵芝酸X(ganoderic acid X,GAX)对人肝母细胞瘤HepG2、HuH6细胞模型和非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic-severe combined immune deficient,NOD-SCID)小鼠皮下移植瘤模型的作用机制,为灵芝酸X的临床应用提供依据.采用CCK-8法检测灵芝酸X对HepG2、HuH6细胞活力的影响;EdU实验检测灵芝酸X对细胞增殖的影响;划痕实验检测灵芝酸X对细胞迁移能力的影响;Hoechst 33258染色检测灵芝酸X对细胞凋亡的影响;建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型,分析对照组及灵芝酸X低、中、高剂量组(5、10、20 mg·kg-1)肿瘤体积和质量;苏木素-伊红(HE)染色评估灵芝酸X的药物毒性.此外,收集HepG2细胞对照组和灵芝酸X高剂量组的细胞,分别进行laber-free蛋白组学分析,筛选差异蛋白并富集相关信号通路,CYTO-ID?染色检测细胞自噬情况,Western blot实验检测相关蛋白的表达量.体外结果显示,灵芝酸X呈剂量依赖性抑制HepG2、HuH6细胞的增殖、迁移、诱导凋亡;体内研究显示灵芝酸X显著抑制肿瘤体积和质量,且对小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)无明显损害;laber-free蛋白组学结果显示灵芝酸X在肝母细胞瘤治疗过程中参与多种信号通路,其中自噬途径高度富集.CYTO-ID ?染色及Western blot结果显示灵芝酸X诱导细胞自噬并上调苄氯素1(Beclin-1)、自噬相关基因5(ATG5)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白表达量,下调螯合体1(p62)蛋白表达量.该研究表明,灵芝酸X通过诱导自噬进而抑制肝母细胞瘤细胞的增殖、迁移和诱导凋亡,并显著抑制肿瘤生长,是一种有希望的癌症辅助治疗药物.

灵芝被广泛应用于食品(保健)、药品和化妆品等领域.灵芝酸A是一种具有重要药理活性的灵芝三萜类化合物.现代药理研究表明,灵芝酸A具有抗肿瘤、抗神经精神系统疾病、肝保护作用、降血脂作用、抗炎和肾保护作用等多种药理作用.本文对灵芝酸A的药理学作用及其机制研究新进展进行梳理与总结,为其进一步开发和应用提供参考.

目的:探讨灵芝三萜联合外源性单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialotetrahexosyl ganglioside，GM1)对戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)致痫大鼠认知功能及海马神经元突触超微结构的影响。方法:将40只雄性清洁级SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、癫痫模型组、灵芝三萜组、GM1组、灵芝三萜联合GM1组，每组8只。采用腹腔注射亚惊厥剂量PTZ( 35 mg·kg -1·d -1)的方法建立慢性癫痫大鼠模型，1次/d，连续28 d；用药各组大鼠在每日腹腔注射PTZ的同时按分组给予相应药物( GM1：腹腔注射30 mg·kg -1·d -1，灵芝三萜：灌胃1 000 mg·kg -1·d -1)。应用Morris水迷宫观测各组大鼠学习记忆能力；透射电镜观察海马神经元突触超微结构；免疫荧光染色法观察大鼠海马CA1区丝切蛋白(cofilin)、突触素(synaptophysin，SYN)的表达，同时用Western blot检测大鼠海马cofilin及其磷酸化p-cofilin和SYN的蛋白表达。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，组间多样本采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD检验。 结果:Morris水迷宫结果显示，各组间的逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间均差异有统计学意义( F＝5.259，8.240，5.961，均 P<0.05)。与癫痫模型组相比，灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组大鼠的逃避潜伏期[(20.31±7.39)s，(21.81±6.05)s，(17.66±4.76)s]均短(均 P<0.05)，穿越平台次数[(4.63±1.41)次，(4.50±1.93)次，(5.50±1.77)次]均多(均 P<0.05)，目标象限停留时间[(31.91±5.00)s，(30.49±5.72)s，(35.70±5.34)s]均长(均 P<0.05)，以灵芝三萜联合GM1组变化最明显( P<0.01)。透射电镜结果显示，各组海马神经元突触数量、突触间隙宽度、突触后致密物厚度、突触后膜活性区长度均差异有统计学意义( F＝3.693，7.201，5.012，4.033，均 P<0.05)。与癫痫模型组比较，灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组神经元突触数量[(8.00±1.79)个，(7.83±1.84)个，(8.50±1.87)个，]均多(均 P<0.05)，突触间隙[(33.83±3.81)nm，(32.43±4.14)nm，(30.23±3.08)nm]窄，突触后致密物质[(57.50±6.03)nm，(58.10±2.40)nm，(60.73±3.81)nm]均厚(均 P<0.05)。灵芝三萜组和灵芝三萜联合GM1组突触后膜活性区长度[(271.66±11.80)nm，(279.06±13.58)nm]均长于癫痫模型组(均 P<0.05)。免疫荧光结果显示，癫痫模型组cofilin平均荧光强度高于空白对照组，SYN平均荧光强度低于空白对照组( P<0.05)；GM1组和灵芝三萜联合GM1组cofilin平均荧光强度均低于癫痫模型组(均 P<0.05)，灵芝三萜联合GM1组SYN平均荧光强度高于癫痫模型组( P<0.05)。Western blot检测发现，癫痫模型组cofilin蛋白表达量高于空白对照组[(1.454±0.080)，(1.092±0.099)， P<0.05]，p-cofilin、SYN的表达量均低于空白对照组[(1.103±0.120)，(1.420±0.934)；(1.650±0.062)，(1.958±0.062)；均 P<0.05]；灵芝三萜组、GM1组和灵芝三萜联合GM1组大鼠海马组织内cofilin蛋白表达[(1.227±0.071)，(1.262±0.078)，(1.162±0.129)， P<0.05]均低于癫痫模型组，灵芝三萜联合GM1组p-cofilin、SYN蛋白表达[(1.357±0.199)，(1.873±0.010)， P<0.05]均高于癫痫模型组。与灵芝三萜组、GM1组比较，灵芝三萜联合GM1组各指标均差异无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:灵芝三萜联合GM1可改善神经元突触可塑性，提高癫痫大鼠学习记忆能力，部分指标优于单独用药。

目的 探讨灵芝酸A(ganoderic acid A,GAA)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导急性肺损伤(acute lung in-jury,ALI)小鼠的影响及作用机制.方法 将小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量GAA组(GAA-L组)、高剂量GAA组(GAA-H组),每组12只.气管内滴注LPS(5 mg·kg-1)构建ALI小鼠模型,GAA-L组和GAA-H组小鼠分别在ALI造模前30 min腹腔注射50或150 mg·kg-1 GAA.造模后12 h,收集肺泡灌洗液(BALF),计数BALF中总细胞和中性粒细胞含量并检测TNF-α和IL-1β含量.收集肝脏,称重法获取肺湿重/干重比值,HE染色观察肺组织形态学表现,检测肺组织中MDA、ROS、GSH和SOD水平,免疫荧光染色检测肺组织中CD31和VCAM-1表达,Western blot法检测肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达.结果 与模型组比较,低和高剂量GAA组小鼠肺组织ALI评分和肺组织的湿/干重比均降低(P＜0.05),病理损伤减轻,BALF中总细胞、中性粒细胞、IL-1β、TNF-α含量均下降(P＜0.05),肺组织中 MDA、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD 蛋白表达均下调(P＜0.05),GSH和SOD水平升高(P＜0.05),且高剂量组的效果显著优于低剂量组(P＜0.05).结论 GAA对ALI小鼠具有肺保护作用,其机制可能与其抑制NL-RP3/GSDMD信号通路,减轻炎症反应、降低氧化应激和抑制细胞焦亡有关.

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap-HRMS)联用技术对灵芝醇提物的化学成分进行系统分析,总结其代表性化学成分的裂解规律,并对灵芝潜在作用于法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)靶点的抗肝纤维化活性物质进行研究,阐明其药效物质基础.初步鉴定出灵芝醇提物95种化学成分,包括灵芝酸类24种、灵芝烯酸类9种、赤芝酸类13种、丹芝酸类3种、灵芝内酯类1种、其他三萜类成分40种、脂肪酸类成分4种、其他类1种,并分析了其裂解规律.如灵芝酸、灵芝烯酸类成分的结构特征以C30为骨架,含有游离的-COOH及-OH,易失去H2O、CO2分子形成碎片离子,D环多为五元环,易发生断裂;赤芝酸类成分属于C27骨架的羊毛甾烷型,与灵芝酸类成分相比其侧链结构变短,由8个碳减少为5个,同灵芝酸类含有常见的游离-COOH、-OH,容易失去H2O、CO2分子.通过选取已报道的6种FXR受体激动剂组成训练集,建立基于FXR配体的药效团模型,以鉴定出的95种灵芝化学成分与药效团进行匹配,通过测试集分子对模型进行验证,选出最优药效团模型02(敏感性=0.750 00,特异性=0.555 56,ROC=0.750)用于对灵芝化合物库的虚拟筛选,经匹配筛选得到31种潜在的可用于激活FXR的灵芝活性成分,随后ADMET预测结果表明灵芝酸H和赤芝酸J与血浆蛋白的结合率低于90％,且无肝毒性,可作为FXR激活剂开发单用或联用治疗肝纤维化的临床药物.

目的:探讨不同剂量灵芝酸A(GAA)对非小细胞肺癌(NSCLC)PC9细胞的生物活性、糖酵解及其限速酶表达的影响,并阐明其作用机制.方法:体外培养NSCLC PC9 细胞,将PC9细胞分为空白对照组、低剂量(25 μmol·L-1)GAA组、中剂量(50 μmol·L-1)GAA组和高剂量(100 μmol·L-1)GAA组.采用噻唑蓝(MTT)法检测各组PC9细胞存活率,Transwell小室实验检测各组PC9 细胞迁移细胞数,葡萄糖检测试剂盒检测各组PC9 细胞葡萄糖摄取量,三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒检测各组PC9细胞中ATP水平,乳酸检测试剂盒检测各组PC9细胞中乳酸水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组PC9 细胞中己糖激酶 2(HK2)和M2 型丙酮酸激酶(PKM2)mRNA 表达水平,Western blotting 法检测各组 PC9 细胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表达水平.结果:MTT法,培养24、48和72 h时,与空白对照组比较,中和高剂量GAA组PC9细胞存活率明显降低(P<0.05);培养72 h时,与低剂量GAA组比较,高剂量GAA组细胞存活率明显降低(P<0.05).Transwell小室实验,与空白对照组比较,中和高剂量GAA组细胞迁移数明显减少(P<0.05);与低剂量GAA组比较,高剂量GAA组细胞迁移数明显减少(P<0.05).与空白对照组比较,中和高剂量GAA组PC9细胞中葡萄糖摄取量和乳酸水平均明显降低(P<0.05),高剂量GAA组PC9细胞中ATP水平明显降低(P<0.05).RT-qPCR法,与空白对照组比较,中和高剂量GAA组PC9细胞中HK2和PKM2 mRNA表达水平均明显降低(P<0.05).Western blotting法,与空白对照组比较,中和高剂量GAA组PC9细胞中HK2和PKM2蛋白表达水平明显降低(P<0.05).结论:中和高剂量GAA可抑制PC9细胞增殖及迁移的生物活性,降低糖酵解作用,其作用机制可能与抑制关键限速酶HK2和PKM2的表达有关.

目的:利用高分辨气相色谱-四级杆-静电轨道阱质谱法(GC-Q-Exactive-MS)定性分析灵芝孢子油的化学成分.方法:采用GC-Q-Exactive-MS,在电子轰击(EI)源下获取化合物的全扫描质谱数据,通过总结脂肪酸类、萜类、甾醇类及醛类化学成分的质谱裂解规律,并检索NIST、MassBank、HMDB、PubChem在线数据库及查阅相关文献,对灵芝孢子油的各类化学成分进行鉴定.结果:从灵芝孢子油中共鉴定了 22 个化学成分,包括 3 个脂肪酸类、4 个萜类、4 个甾醇类、4 个醛类及 7 个其他类化合物.结论:研究结果为灵芝孢子油质量控制和中药弱极性化学成分定性分析提供了参考.

目的 以中药药性作为特征描述符构建机器学习抗辐射作用预测模型,并解释抗辐射中药药性的重要药性特征以指导临床和日常辐射防治.方法 通过药智网、中国知网、PubMed等数据库获取报道具有抗辐射作用的中药研究文献,通过SymMap数据库获得《中国药典》等权威著作记载的中药性味归经等药性作为特征描述符构建数据库,并将数据处理为适合机器学习的格式.使用随机森林、支持向量机、梯度提升、逻辑回归、全连接神经网络5种机器学习模型对数据集进行五折交叉训练并进行性能评估,再使用10个未参与训练的报道具抗辐射作用的中药和10个报道无抗辐射作用的中药作为外部验证集测试模型,最后利用SHapley加性解释(SHapley additive ex planations,SHAP)解释器对决定抗辐射作用有无的重要药性特征进行可视化.结果 收集到涉及单味药研究、保健食品注册和复方研究共136味报道具抗辐射作用的中药,总频次为447次,其中中药使用频次及频率排名前3的为灵芝、红景天、枸杞子,频次≥10的中药共10味.在5个机器学习的性能评估中,随机森林性能最佳,其准确率、平衡F分数(F1)和曲线下面积(area under urve,AUC)分别为0.8044、0.773 2和0.879 8.在外部中药抗辐射的验证中,随机森林模型能较好地预测已报道具有抗辐射作用的中药.性能最佳的随机森林SHAP解释器认为"补虚、清热"功效,"心、肝、脾、肺"归经,"酸、甘、苦"味,"寒"药性特征对抗辐射作用贡献最大.结论 首次将中药药性作为特征描述应用到机器学习当中并取得了较好的预测模型性能,并指导了放射病的中医药防治,即当以扶正祛邪,滋阴降火,主治心、肝、脾、肺为治疗原则.此外,机器学习模型较好的预测结果反映了中医药理论对疾病的防治具有良好的可解释性与可重现性.

目的:探讨灵芝酚通过AGE/RAGE信号通路对慢性肾脏病(CKD)大鼠炎症反应及肾脏纤维化的影响.方法:将40只SD雄性大鼠分为模型组、灵芝酚低剂量组、灵芝酚中剂量组、灵芝酚高剂量组,另选取健康大鼠设空白对照组,每组10只.空白对照组、模型组均注射等容量生理盐水,灵芝酚低、中、高剂量组分别给予5、10、20mg/kg灵芝酚.给药结束后采用免疫透射比浊法检测肾功能;采用酶联免疫吸附法检测炎症因子和肾脏纤维化;并称大鼠体质量、测定肾脏质量计算肾脏指数,评估肾脏病变评分.结果:模型组、灵芝酚(低、中、高剂量)组血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)水平均高于空白对照组;灵芝酚(低、中、高剂量)组BUN、SCr、UA水平均高于模型组(P＜0.05).与空白对照组比较,模型组、灵芝酚(低、中、高剂量)组体质量较低,肾脏指数、病变评分较高;与模型组比较,灵芝酚(低、中、高剂量)组体质量较高,肾脏指数、病变评分较低(P＜0.05).血清C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)比较,模型组、灵芝酚(低、中、高剂量)组均高于空白对照组;灵芝酚(低、中、高剂量)组均低于模型组(P＜0.05).血清透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平比较,模型组、灵芝酚(低、中、高剂量)组均高于空白对照组;灵芝酚(低、中、高剂量)组均低于模型组(P＜0.05).结论:灵芝酚通过AGE/RAGE信号通路可有效抑制炎症反应和肾脏纤维化,同时还能改善肾功能,对CKD大鼠起到一定保护作用.

目的 通过网络药理学、分子对接技术和动物实验探究白肉灵芝醇提物(GLE)对矽肺的改善作用及其潜在分子机制.方法 (1)采用超高液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱法(UPLC-QE-MS)分析GLE成分;利用网络药理学和分子对接技术,探究GLE干预矽肺炎症进程中的活性成分及调控的潜在分子通路和靶点.(2)将无特定病原体级雄性C57BL6/J小鼠分为4组,每组10只.采用非暴露式气管滴注法,矽肺模型组和GLE干预组小鼠一次性予质量浓度为50 g/L的二氧化硅混悬液80 μL染尘,空白对照组和GLE对照组小鼠均予等体积的无菌0.9％氯化钠溶液;造模后第2天起,GLE对照组和GLE干预组小鼠均予剂量为200 mg/(kg·d)的GLE灌胃,空白对照组和矽肺模型组小鼠均予等体积0.9％氯化钠溶液灌胃,每日1次,连续35 d.实验结束后,观察各组小鼠肺组织病理学改变情况,计算肺质量系数、炎症评分和胶原沉积面积占比,采用酶联免疫吸附实验检测肺组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平.结果 (1)UPLC-QE-MS技术检测出GLE的76种活性成分;其中,36种成分满足类药性五原则筛选条件.基于网络药理学理论,该36种GLE活性成分中共筛选出改善矽肺炎性反应的潜在作用靶点67个.京都基因与基因组百科全书富集分析和基因本体论功能分析结果显示,IL信号和免疫细胞的细胞因子信号在GLE改善矽肺的过程中发挥关键作用.分子对接结果显示,67个交集靶点中,排名基于前10的依次是TNF、IL6、B淋巴细胞瘤2、细胞肿瘤抗原p53、半胱氨酸蛋白酶-3亚基p12、JUN、表皮生长因子受体、IL1B、67 kDa基质金属蛋白酶-9和前列腺素G/H合酶2.蛋白质-蛋白质相互作用分析结果显示,与关键靶点TNF-α、IL-1β、IL-6亲和力最强的成分是甘草次酸;其次为灵芝酸DM、泽泻醇C、灵芝酸β和红光皂苷元.(2)组织病理学检查结果显示,GLE可缓解矽肺小鼠模型的肺部炎症反应和胶原沉积.GLE干预组小鼠肺质量系数、炎症评分、胶原面积占比和IL-6水平均低于矽肺模型组(P值均＜0.05);但该2组小鼠肺组织中TNF-α和IL-1β水平分别比较,差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论 GLE可能通过抑制小鼠肺组织中IL-6水平而改善二氧化硅所致肺组织炎症和纤维化;其机制具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点.