目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

目的:通过筛选能成功诱导人牙髓细胞（human dental pulp cell，HDPC）向成牙本质细胞样细胞分化的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的有效浓度，探讨体内诱导HDPC进行牙本质再生的ATP适宜浓度。方法:用0（对照组）、10、400、600、800 μmol/L ATP处理HDPC后，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）和蛋白质印迹法分别检测HDPC增殖以及成牙本质分化相关基因和蛋白[牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）]的表达；用茜素红染色评估诱导21 d后矿化结节情况（各组样本量均为5），并溶解矿化结节后定量分析各组溶液吸光度值（ A值）。筛选既能有效诱导HDPC成牙本质向分化，又能降低ATP对HDPC增殖抑制作用的浓度作为ATP的适宜浓度，并选用此浓度进行动物体内实验。HDPC经此浓度ATP预处理7 d后接种于明胶海绵上，并置入6~7 mm长、管径1.0~2.5 mm的人牙根管片段内（ATP处理组，样本量为8）；非ATP处理组的明胶海绵接种未经ATP预处理的HDPC（样本量为8），空白对照组的明胶海绵未接种细胞（样本量为2）。各组根管片段移植于免疫缺陷鼠（9只）背部双侧皮下，3个月后取材进行HE染色和组织学观察。 结果:培养5 d时与对照组相比，10 μmol/L ATP组HDPC增殖显著增加（ P<0.05），而600和800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著减小（ P<0.05），且800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著小于600 μmol/L ATP组（ P<0.05）。与对照组相比，600和800 μmol/L ATP组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均显著上调（ P<0.05），且两组间差异无统计学意义（ P>0.05），而其他各组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均无显著上调（ P>0.05）。诱导21 d后600和800 μmol/L ATP组均可见明显的矿化结节，其他组均未见矿化结节；定量分析显示0、10、400、600、800 μmol/L ATP组 A值分别为1.05±0.15、1.11±0.23、1.15±0.17、3.65±0.30、3.40±0.43，600与800 μmol/L ATP组 A值均显著大于其他各组（ P<0.05），且600与800 μmol/L ATP组间差异无统计学意义（ P>0.05）。HE染色结果显示，600 μmol/L ATP可诱导HDPC在根管牙段内分化形成牙本质样结构。 结论:600 μmol/L为ATP诱导HDPC成牙本质向分化的适宜浓度，该浓度ATP可在免疫缺陷小鼠体内诱导HDPC形成牙本质样结构。

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法.目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响.方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力.将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达.结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05).结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力.

目的 评价添加无定形纳米磷酸钙(nanoparticles of amorphous calcum phohate,NACP)和甲基丙烯酰氧乙基-正十六烷基-二甲基氯化铵(methacryloxylethyl cetyldimethyl ammonium chloride,DMAE-CB)的黏结剂的黏结性能和再矿化性能.方法 分别合成NACP和DMAE-CB,将NACP和DMAE-CB按不同比例添加到商品牙本质黏结剂中,按添加两种成分比例的不同,将实验分为8组,A:黏结剂+25％NACP+3％DMAE-CB;B:黏结剂+35％NACP+4％DMAE-CB;C:黏结剂+15％NACP+1％DMAE-CB;D:黏结剂+15％NACP+4％DMAE-CB;E:黏结剂+35％NACP+1％DMAE-CB;F:黏结剂+3％DMAE-CB;G:黏结剂+25％NACP;H:SBMP黏结剂对照组.制备剪切强度试件,用万能材料试验机测试各组试件的机械性能.制备脱矿牙本质片,将以上制备的8组黏结剂试样分别涂布在脱矿牙本质片表面,放置于37 ℃人工唾液中浸泡4周.取出浸泡后的牙本质片经超声冲洗、干燥、喷金后,用扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)和能谱仪(energy spectrometer,EDS)观察牙本质片表面形貌和钙、磷含量及比值.结果 机械性能结果显示,实验组和对照组的抗剪切强度差异无统计学意义(P=0.882＞0.05);通过扫描电镜观察发现,牙本质再矿化结果:H组和F组牙本质小管孔塌陷,未见矿物沉积,能谱仪显示牙本质表面几乎不含钙、磷元素;A、B、C、D、E、G组牙本质表面观察到弥漫性或团聚状的矿物晶体,且大部分牙本质小管被新形成的矿物质封闭,能谱仪显示有钙、磷峰,其中经A(黏结剂+25％NACP+3％DMAE-CB)、G(黏结剂+25％NACP)组黏结剂处理的牙本质表面钙、磷比值分别为1.70、1.79,接近天然牙本质羟基磷灰石钙、磷比值1.67.结论 添加了 NACP和DMAE-CB的黏结剂固化后,不影响黏结强度,且具有良好的再矿化性能,添加25％NACP的黏结剂再矿化性能最好.

目的 制备并鉴定白藜芦醇和环糊精包合物,分析包合物对牙本质再矿化的影响.方法 以环糊精、白藜芦醇为原料,采用冷冻干燥法制备白藜芦醇-环糊精包合物,采用FTIR、TG对包合物结构进行表征.通过CCK8比较白藜芦醇和包合物的细胞毒性.SEM分析包合物对牙本质再矿化的影响.结果 FTIR图示,与游离白藜芦醇相比,包合物出现了不同频带信号强度降低及消失.热重结果示,白藜芦醇在345℃时迅速发生质量损失,环糊精-白藜芦醇包合物组在342℃时迅速发生重量损失.这些表征证明白藜芦醇被成功包含在环糊精内.CCK8结果示白藜芦醇在浓度为5 μg/mL时已经表现出明显细胞毒性,包合物组在10 μg/mL时才表现出明显细胞毒性.白藜芦醇被环糊精包合后,细胞毒性降低.SEM图显示,对比纯酸蚀组,白藜芦醇及两种包合物处理后,牙本质脱矿处均出现矿物质生成,包合物组牙本质矿物质生成更为明显.结论 环糊精能够成功包合白藜芦醇形成包合物,包合物能够促进牙本质再矿化.

目的 评价白藜芦醇对脱矿牙本质仿生再矿化及树脂-牙本质粘接耐久性的影响.方法 低速切割机下切取的中层牙本质经35%磷酸酸蚀脱矿后随机分为3 组并分别给予蒸馏水浸泡(Ctr组)、直接再矿化处理7 d(Pos组)和白藜芦醇预处理 30 min后再矿化处理 7 d(Res组).采用扫描电镜观察牙本质表面矿物质生成情况,X射线衍射和衰减全反射傅里叶变换红外光谱分析牙本质表面晶体的特征,微拉伸强度实验观察树脂-牙本质粘接耐久性.结果 扫描电镜发现仿生再矿化处理的各组牙本质表面均可以形成矿物晶体,白藜芦醇预处理后的牙本质表面更为明显,新形成的晶体经X射线衍射和衰减全反射傅里叶变换红外光谱分析为羟基磷灰石.与没有预处理剂的阳性对照组相比,白藜芦醇预处理显著增加了初始微拉伸强度值.微拉伸强度值在老化过程中减小,但白藜芦醇预处理的样本该值下降程度最低.结论 白藜芦醇预处理可以促进脱矿牙本质的仿生再矿化并改善树脂-牙本质的粘接耐久性.

目的:通过制备介孔二氧化钛复合羟基磷灰石来封闭离体牙本质小管评估其脱敏效果.方法:制备含介孔二氧化钛的羟基磷灰石复合材料与纯羟基磷灰石以及常用的齿科脱敏剂应用于离体牙本质表面,观察牙本质小管的封闭情况和封闭材料渗入小管内的距离来评估封闭效果,比表面积测试等方法对其组成及性状进行分析,讨论其对离体牙本质体外再矿化的影响和封闭机制.结果:介孔二氧化钛复合羟基磷灰石可以很好地封闭离体牙本质表面的微孔,复合物具有良好的孔隙率及较高的表面能.结论:介孔二氧化钛复合羟基磷灰石可以尝试作为牙齿修复后的脱敏材料.

目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制.方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养.通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性.通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系.通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平.结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09％,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13％(P＜0.05).与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89％,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32％(P＜0.05).与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了 2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26％、58.84％和68.12％(P＜0.05).双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P＜0.05).过表达SMURF1抑制了 miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P＜0.05).结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化.

精氨酸是唾液的天然成分之一,具有促进钙磷离子沉积于牙本质表面和牙本质小管的能力,同时具有隔绝外界刺激、延缓牙本质敏感的作用.而且,精氨酸作为细菌产碱代谢底物不仅参与口腔微生态平衡的调控,其抑制致龋细菌的能力以及促进早期釉质龋再矿化的作用等方面也越来越得到学者们的重视.本文就精氨酸在口腔疾病防治中的研究现状以及应用情况作一综述.

目的 体外培养人根尖乳头干细胞(Stem cells from apical papilla,SCAP)与牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),比较两者成骨及成牙本质能力,为干细胞应用于牙根再生研究提供理论依据.方法 采用酶消化结合组织块化法获得SCAP及PDLSCs,通过流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物CD90、CD146的表达,采用CCK-8法测定SCAP及PDLSCs生长曲线;通过茜素红染色、实时定量PCR,检测SCAP及PDLSCs成骨能力;实时定量PCR检测SCAP及PDLSCs牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达.结果 流式细胞仪检测结果显示两种细胞CD105、CD90及CD146表达阳性;CCK-8法结果显示SCAP增殖活力高于PDLSCs(P<0.05);茜素红染色结果显示,与PDLSCs相比,SCAP矿化结节增多;qRT-PCR结果显示,SCAP骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)较PDLSCs表达量升高(P<0.05);牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)同样较PDLSCs表达水平高(P<0.05).结论 根尖乳头干细胞与牙周膜干细胞相比有较强的增殖、成骨及成牙本质能力.