牛樟芝是一种具有良好护肝功能的高等药用真菌,且具有浓郁的芳香.本文利用牛樟芝对碎红茶进行发酵,分析牛樟芝发酵茶风味特征以及对HepG 2细胞酒精损伤的保护作用.研究结果显示,青稞等淀粉质辅料能够促进牛樟芝在碎红茶上的生长.GC-MS分析显示牛樟芝发酵茶含有69种风味成分,主要含有醛类23种、醇类14种、酮类13种,酯类4种、呋喃类4种、吡嗪类3种以及其他5种等.HepG2体外活性分析表明,牛樟芝发酵茶水提物能够有效地保护肝细胞酒精损伤,与模型组相比细胞存活率提高了230％,细胞数量、形态以及贴壁性能得到显著改善.

牛樟芝(Antrodia camphorata)是一种珍稀食药用菌,能产生具有抗癌活性的倍半萜类化合物.对牛樟芝基因组进行分析,获得倍半萜合酶基因序列并设计特异引物,提取在Glu培养基(麦芽浸粉6g/L,酵母提取物3 g/L,葡萄糖40 g/L)上生长的牛樟芝菌丝体的RNA,利用RT-PCR技术克隆得到倍半萜合酶基因AcTPS1.AcTPS1基因cDNA全长为969 bp,编码323个氨基酸,根据系统进化树可知AcTPS1氨基酸序列与其他9种真菌倍半萜合酶聚为一类.AcTPS1拥有典型倍半萜合酶的结构域(RRSRSATAEAYACFIW),之后检测AcTPS1在不同培养基上的菌丝中的表达结果显示不同碳源中,只有葡萄糖作为碳源时该基因表达,不同氮源中,以番茄浸粉和酪蛋白胨为氮源时该基因表达.说明AcTPS1是一类诱导型表达的基因.为利用发酵培养以及异源表达手段获得牛樟芝活性化合物提供参考.

为研究牛樟芝(Antrodia camphorata)萜类生物合成MVA途径中关键酶3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)的调控机制,从牛樟芝基因组中分离并克隆出AcHMGR基因,对其进行生物信息学分析、不同碳氮源添加物对该基因的诱导表达情况进行分析.分析显示:AcHMGR基因含7个外显子、6个内含子;开放阅读框为3 402 bp,编码1 133个氨基酸残基组成蛋白质序列;AcHMGR包含HMGR典型的多肽位点,即2个HMG-CoA结合基序:PLG (I/V) AGPLK (I/V) DG和AEGTLVASTSRG,2个NADP结合基序:TGDAMGMNMI和IEVGT (I/V) GGGT;分子系统进化分析显示,AcHMGR蛋白序列与其他多孔菌科真菌的HMGR聚为一支;表达谱分析显示:碳源中的果糖、氮源中的酪蛋白胨诱导表达AcHMGR基因的能力最强.本研究为探讨牛樟芝萜类,尤其是三萜类化合物的生物合成及调控机理提供了帮助.

药食用真菌是世界公认的具有良好疗效的药食同源物质.然而,其中主要生物活性的成分尚未研究透彻.在本研究中,我们研究了虫草头孢Cephalosporium sinensis、蝙蝠蛾被孢霉Mortierella hepiali、猴头菌Hericium erinaceus、灵芝Ganoderma lingzhi、蜜环菌Armillaria mellea、牛樟芝Antrodia cinnamomea等6种菌丝体的正己烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇提取物的降糖降脂活性.我们通过人类肝癌细胞株HepG-2建立了胰岛素诱导的胰岛素抵抗模型和油酸(OA)诱导的甘油三酯(TGs)沉积模型,并对24种提取物的降糖降脂活性进行了功能评价.结果表明在无细胞毒性的作用浓度下＜300μg/mL),猴头菌和灵芝的正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇提取物以及虫草头孢的正己烷提取物剂量依赖性的增加HepG-2细胞葡萄糖的消耗;虫草头孢的正己烷、乙酸乙酯、甲醇提取物以及灵芝的正己烷、乙酸乙酯提取物和蝙蝠蛾被孢霉的正己烷提取物剂量依赖性的抑制OA诱导的TGs合成.这些结果表明,药食用真菌可以被用来调控糖脂代谢紊乱.

目的 克隆牛樟芝三萜合成途径中鲨烯环氧酶基因(AcSE),并进行生物信息学和表达差异分析.方法 以牛樟芝菌丝体cDNA为模板,利用快速末端扩增(RACE)进行AcSE序列扩增,利用生物信息学分析AcSE基因的理化性质并预测其蛋白二级结构、三级结构及其功能;同时利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定不同培养时间的液体牛樟芝菌丝体及子实体中AcSE基因的表达情况.结果 AcSE的cDNA全长1446bp (GenBank编号:KT070558),编码481个氨基酸,相对分子质量为53 300,等电点为6.36.结构域分析表明AcSE内含3个跨膜的结构域,无卷曲螺旋结构,且疏水区和亲水区交替存在.AcSE的gDNA全长为1 607 bp,含4个外显子和3个内含子.AcSE在液体培养7d的牛樟芝菌丝体中表达量最高,为子实体的7.89倍,且随着培养时间的延长逐渐下降.结论 首次从牛樟芝中克隆了AcSE基因,为进一步阐明该基因在牛樟芝三萜合成途径中的作用奠定基础.

本文研究台湾特有牛樟芝子实体醇提物对过敏性肺炎的作用并探讨其可能的作用机制.体内实验采用卵清蛋白(OVA)致敏制备过敏性肺炎模型,观察各组肺组织病理变化情况,并对脂多糖(LPS)诱导的细胞分泌促炎性细胞因子进行检测;离体实验中采用酶联免疫吸附法(E LISA)对LPS刺激THP-1细胞分泌促炎性因子(IL-1、IL-6及TNF-a)进行了检测.体外巨噬细胞(THP-1)抗炎试验结果显示牛樟芝子实体醇提物不同浓度均可显著抑制LPS诱导的THP-1细胞IL-1的分泌(P＜0.001);可完全抑制IL-6的分泌;浓度20μg/mL及80μg/mL下可以完全抑制TNF-α的分泌.OVA过敏性肺炎动物模型中,与模型组相比,牛樟芝子实体醇提物组可显著改善肺部外观色泽、细支气管淋巴球聚集、肺泡壁增生及肺泡空腔等炎症程度.口服KBA皿式牛樟芝子实体醇提物可有效改善过敏性肺炎程度,并有全身系统性抗炎效果,其机制可能为抑制THP-1细胞IL-1、IL-6及TNF-α的分泌.本研究为深入研究KBA皿式牛樟芝子实体改善雾霾性肺炎提供了重要的实验依据.

为了研究牛樟芝中PKS基因与化合物之间的关系,该研究通过对牛樟芝基因组分析获得牛樟芝聚酮合酶基因,以此序列为模板设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物并以牛樟芝cDNA为模板克隆获得一个高度还原型PKS(HR-PKS)基因全长,命名为AcPKS2;对AcPKS2基因进行生物信息学分析,并比较该基因在不同培养基上的表达量.结果表明:AcPKS2全长7842 bp,有24个内含子,其外显子共编码2613个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为293.5 kDa,理论等电点pI为5.78.用CDD分析其结构域显示,该基因属于HR-PKS,其结构域组织排列为KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE,8个结构域其活性位点分别为 β-酮基合成酶(DTACSSSL)、酰基转移酶(GHSIGETA)、脱水酶(RNDGSTSPL)、甲基转移酶(SFDIITAFDV)、烯酰还原酶(HAGVSSPAA)、酮基还原酶(GSPGQANYTAA)、酰基转移酶(YGLDSLTSVRL)、硫酯酶(KQPNGPY).系统发育树显示AcPKS2与其他化合物未知的HR-PKS蛋白聚为一支,结构域和系统进化树分析显示该基因可能编码一种新的含TE结构域高度还原型聚酮合酶;表达分析结果显示葡萄糖和果糖能够诱导该基因的表达.

目的 获得牛樟芝聚酮合酶基因(AcPKS1)全长,对其进行生物学分析并分析该基因在不同培养基上的表达差异.方法 通过对牛樟芝基因组分析获得牛樟芝聚酮合酶基因,通过设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物并以牛樟芝cDNA为模板克隆得到AcPKS1基因全长,并对该基因进行生物信息学分析及在不同培养基上的表达谱分析.结果 AcPKS1全长6 348 bp,含有6个内含子和7个外显子,外显子编码2 115个氨基酸;通过生物信息学分析,推测该基因为真菌Ⅰ型非还原型PKS,结构域为SAT-KS-PT-ACP-ACP-TE,系统树分析显示AcPKS1与其他未知功能的聚酮合酶(PKS)聚为一支,说明AcPKS1可能是一种新的聚酮化合物环化方式;表达谱分析表明,葡萄糖为AcPKS1基因表达的必要条件,且葡萄糖含量与AcPKS基因表达量呈正相关.结论 本研究为AcPKS1功能鉴定以及牛樟芝基因资源利用奠定基础.

建立皿培式培养牛樟芝Antrodia camphorate中3种樟芝酸类成分(25S)-antcin K,(25R)-antcin K,(25S)-antcin C的一测多评法,该研究优化了皿培式培养牛樟芝质量控制的HPLC指纹图谱条件,实现其主含成分(25R)-antcin K和(25S)-ant-cin K的基线分离.以(25S)-antcin C为内参物,测定(25S)-antcin K和(25R)-antcin K的相对校正因子,计算皿培式培养牛樟芝中难以大量制备的这一对差向异构体的含量,实现一测多评.同时,采用外标法测定皿培式培养牛樟芝中3种樟芝酸类成分的含量,并将其含量测定结果与一测多评法测定结果进行比较,结果显示一测多评法与外标法测定结果无显著差异.因此,以(25S)-antcin C为内参物,利用一测多评法测定(25S)-antcin K和(25R)-antcin K可应用于皿培式培养牛樟芝的定量分析.

为了解牛樟芝中聚酮化合物的生物合成机理及聚酮合酶基因功能,从牛樟芝基因组挖掘并克隆得到一个部分还原型PKS(PR-PKS)基因(AcPKS3),并对其进行生物信息学分析及表达谱分析.结果显示,AcPKS3(GenBank登录号:MG988206)DNA全长8286 bp,有22个内含子,其外显子共编码2285个氨基酸;结构域依次为KS-AT-KR-ACP-SDR,各结构域的活性保守位点为β-酮基合成酶(DTACSS)、酰基转移酶(GHSAGETA)、酮基还原酶(YLLVGGIG)、酰基转移酶(YGLDSITSA)、短链醇脱氢酶与NAD(P)H结合的N端保守序列(IT-GTTGSFG)及活性保守位点(YTESK);AcPKS3与6-甲基水杨酸合成酶的亲缘关系较近;不同碳源中葡萄糖,不同氮源中牛肉浸粉、酪蛋白胨、土豆蛋白胨可促进AcPKS3基因表达.本研究为牛樟芝聚酮合酶功能研究及牛樟芝基因资源利用提供参考.