目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

主动脉夹层(aortic dissection,AD)是一类在发病早期极易被误诊或忽视的心血管疾病,影像学检查多用于该病的确诊,但诊断耗时.生物学标志物检测操作简单,检测速度快,不仅用于AD早期诊断,还与疾病的发生、发展以及预后密切相关.平滑肌肌球蛋白重链、α-平滑肌肌动蛋白(α-SAM)参与了血管平滑肌细胞的表型转换;C反应蛋白可作为患者预后不良结局的独立预测因子;峰值降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可作为A型AD出现急性肾功能损伤的潜在预测指标;D-二聚体是AD重要的诊断标志物,其阴性可排除AD;新型标志物(如非编码RNA分子)过表达可减缓AD进展,以达到治疗效果.该文旨在对早期诊断AD的生物学标志物作一综述,以期探讨其生物学特点及临床应用价值.

目的 通过生物信息学分析,寻找与银屑病发病密切相关的特征基因,并探寻中药复方对其作用机理.方法 利用中药系统药理学数据库(TCMSP)对健脾解毒汤的药物作用靶点进行研究.通过OMIM数据库、GeneCard数据库以及GEO数据库筛选银屑病的病理靶点;使用R包对基因进行功能注释;从NCBI GEO公共数据库下载银屑病数据集GSE13355的基因表达数据;通过Cytoscape建立"活性成分-靶点"网络;采用WGCNA方法,寻找协同表达的基因模块;利用WGCNA-R包构建数据集中基因的共表达网络;采用CIBER-SORT算法推断22种免疫浸润细胞的相对比例,并进行Pearson相关性分析;通过miRcode数据库获得关键基因相关的miRNA.统计分析采用R语言(version4.2.1)进行.结果 最终得到对应药物靶点共132个,将药物靶点与疾病靶点取交集,得43个交集靶点.GO和KEGG富集分析主要涉及cellular response to chemical stress、response to oxidative stress、gland development、HIF-1、Th17 cell differentiation、PI3K-Akt等信号通路.WGC-NA分析共检测到8个基因模块,其中black模块相关性绝对值最高,将black模块中筛选后得到的912个基因与43个交集靶点取交集,结果显示,ABCC1、BIRC5、PCNA这3个基因均有交集,关键基因与多种免疫细胞显著相关.对关键基因和铁死亡相关基因进行相关性分析,关键靶点的表达水平和铁死亡相关基因的表达水平显著相关.结论 ABCC1、BIRC5、PCNA、AIFM2、BECN1和GPX4在银屑病中具有重要的生物学功能,为今后的新药研发奠定基础.

目的:分析DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）在乳腺癌中的表达及其对预后的影响，探究其在乳腺癌发生发展中及潜在靶点作用。方法:通过R语言程序分析TCGA乳腺癌数据库，使用UALCAN、Starbase database、cBioPortal、GeneMANIA、STRING等在线数据库分析DNMT3B在乳腺癌中的表达、诊断和预后价值、肿瘤免疫微环境、GO功能、KEGG信号通路和蛋白相互作用。采用qRT‐PCR检测DNMT3B在常见乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞间的表达差异。结果:在线数据库分析及验证实验提示DNMT3B在乳腺癌中高表达，且其高表达不利于乳腺癌患者的生存，提示DNMT3B可能具有诊断价值。通过GO功能、KEGG信号通路和蛋白相互作用以及肿瘤免疫微环境分析，提示DNMT3B参与乳腺癌发生发展的多种机制，可能成为新的治疗靶点。结论:DNMT3B能促进乳腺癌的发生并影响疾病的进展，可能是乳腺癌潜在的肿瘤标志物及治疗靶点。

目的 基于Ms2噬菌体制备内含仙台病毒(Sendai virus,SeV)RNA的假病毒装甲RNA标准质控品,以期应用于SeV感染的诊断及该病毒的分子生物学安全检测.方法 将SeV的L基因片段插入质粒pET-28b-Ms2中,构建重组质粒pET-28b-Ms2-L(SeV).将重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,即SeV假病毒装甲RNA标准质控品.将标准质控品置电镜下观察其形态,并进行10％SDS-PAGE分析、抗DNase Ⅰ及抗RNsaeA试验、稳定性分析.采用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术对SeV、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)、汉坦病毒(Hantaan virus,HV)、呼肠弧病毒 Ⅲ 型(reovirus type Ⅲ,ReoⅢ)、小鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)进行检测,验证标准质控品的效果.结果 标准质控品于电镜下呈Ms2噬菌体假病毒颗粒结构,相对分子质量约为14 000,可有效抵抗DNase Ⅰ及RNsaeA的降解.标准质控品于-80 ℃保存6个月、-20 ℃保存6个月、28 ℃保存5、10、15 d后仍具有良好的稳定性.仅SeV可见RPA特异性扩增曲线,其他病毒均未出现扩增曲线.结论 本研究构建的SeV假病毒装甲RNA标准质控品具有良好的稳定性及特异性,可作为SeV的各项分子生物学安全检测的阳性对照.

目的:探讨可视化角膜生物力学分析联合Pentacam相关指数在诊断亚临床期圆锥角膜及顿挫期圆锥角膜中的诊断价值,为早期圆锥角膜筛查及诊断提供依据.方法:采用诊断试验研究设计,纳入2018-11/2019-11期间在宁夏眼科医院的圆锥角膜患者65例128眼,根据病程程度分别将这些眼分为临床期、亚临床及顿挫期组.选取同时期接受屈光术前检查者89例89眼为正常对照组.应用Pentacam联合Corvis ST进行检测,记录角膜扩张的指标(BAD-D、TP、Kmax、Df、Db、Dp、Dt、Da、ARTh)、角膜生物力学指标(CBI、DA Ratio、SP-A1、Integrated radius)、bIOP及TBI.对不同圆锥角膜分期进行统计分析,依据受试者工作曲线探讨TBI、CBI及BAD-D的诊断阈值,评估各参数的诊断价值.结果:临床期圆锥角膜组TBI、BAD-D、TP、Kmax、Df、Db、Dp、Dt、Da、ARTh、CBI、SP-A1具有较强诊断能力.亚临床期圆锥角膜组 BAD-D、Da、Dp、TP、TBI、CBI、ARTh、Integrated radius具有较强诊断能力.顿挫期圆锥角膜组BAD-D、Dp、TBI具有一定的诊断预测能力.结论:TBI、BAD-D、Dp等指数对早期圆锥角膜诊断具有一定的敏感性和特异性,诊断能力较强,可以用于圆锥角膜的筛查和早期诊断.

缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是一种多因素、异质性的神经系统疾病,病死率和复发率高,严重威胁人类生命健康.目前IS确诊主要依赖于影像学检查,缺乏有效用于临床实践的生物学标志物,早期预防、诊断和有效治疗仍然是IS诊治面临的主要挑战.随着蛋白质组学、代谢组学及表观遗传学研究的深入,目前已发现多种血清标志物、蛋白质、代谢相关分子、非编码RNA、DNA甲基化分子等具有IS早期诊断和预后评估的潜能.该文旨在总结和分析近年来新发现的IS新型诊疗标志物的研究现状及检测技术进展,以期促进具有临床应用价值的IS新型标志物的应用研究,推动IS的精准诊疗.

目的 在锂-毛果芸香碱(Lithium-Pilocarpine)致痫大鼠模型中,检测炎症小体的激活,观察小胶质细胞的活化和异常新生神经元的形成,探索炎症小体激活小胶质细胞促进异常新生神经元形成在癫痫发生发展中的作用机制.方法 通过腹腔注射氯化锂和毛果芸香碱建立癫痫大鼠模型,将大鼠分为Sham组(生理盐水对照组,n=12)、Pilo组(锂-毛果芸香碱致痫组,n=20)和Pilo+MCC950组[锂-毛果芸香碱致痫后给予核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)抑制剂组,n=20],在急性期观察记录大鼠癫痫的行为学表现,通过病理切片确认脑组织损伤情况和细胞激活情况,借助分子检测确认炎症小体和其他分子的表达情况.采用体外细胞模型挽救实验验证炎症小体的作用.结果 Pilo组大鼠有6只出现V级,5只出现Ⅳ级,2只出现Ⅲ级的癫痫发作情况.相较之下,Pilo+MCC950组大鼠则没有出现Ⅴ级,6只出现Ⅳ级,8只出现Ⅲ级,2只出现Ⅱ级的癫痫发作情况.Pilo组强直痉挛发作的潜伏期短于Pilo+MCC950组,Ⅲ级以上癫痫发作的次数和持续时间大于Pilo+MCC950组.Pilo组NLRP3和pro-caspase-1的含量、4种促炎细胞因子的含量以及脑源性神经营养因子(BNDF)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)均高于Pilo+MCC950组.免疫荧光检测显示,Pilo组小胶质细胞大量活化,出现大量异常新生神经元.体外细胞实验后,ELISA结果验证了炎症小体的作用.结论 在锂-毛果芸香碱致痫大鼠模型中,炎症小体NLRP3接受外界炎症刺激而活化聚集,进而大量产生多种促炎细胞因子,使得小胶质细胞活化,分泌BDNF并激活ERK信号通路,调控异常新生神经元的形成和聚集等生物学行为,参与癫痫的发生发展.

目的:探讨结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)混合感染的检测方法,为临床诊治混合感染提供参考依据.方法:使用脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌3种NTM和MTBC标准菌株(H37Rv)各制备3种不同初始浓度(10-2 mg/ml、10-4 mg/ml和10-6 mg/ml)的菌液,将每个浓度的NTM与MTBC采用9种不同比例(NTM标准菌株与H37Rv按照 1∶99、5∶95、10∶90、20∶80、50∶50、80∶20、90∶10、95∶5 和 99∶1)混合制成 81 种混合感染标本.3 种感染模型分别为脓肿分枝杆菌和H37Rv、鸟分枝杆菌和H37Rv、胞内分枝杆菌和H37Rv.经BACTEC MGIT 960培养,采用MPB64抗原检测、对硝基苯甲酸(PNB)生长试验、荧光PCR熔解曲线法和恒温扩增实时荧光法4种方法对培养液进行检测.结果:3种混合感染模型的81份标本均在34 d内报告阳性.其中,MPB64抗原检测阳性3份(3.7％,3/81);PNB生长试验阳性78份(96.3％,78/81);荧光PCR熔解曲线法仅检出相应的NTM 64份(79.0％,64/81),仅检出 MTBC 3 份(3.7％,3/81),同时检出相应的 NTM 和 MTBC 14 份(17.3％,14/81);恒温扩增实时荧光法检出MTBC 67份(82.7％,67/81).结论:临床标本经BACTEC MGIT 960培养,仪器报告阳性后,用MPB64抗原检测和PNB生长试验初判,若有NTM生长,建议采用分子生物学方法鉴定NTM,同时用单一检测MTBC核酸的方法对培养液进行检测,以免MTBC漏检.

目的:探讨化瘀解毒汤对多发性骨髓瘤(MM)细胞恶性生物学特性的影响及其分子机制,为抗MM的中医替代治疗提供实验基础与理论依据.方法:采用不同浓度化瘀解毒汤干预骨髓瘤U266细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性改变情况,Annexin V/PI双染流式细胞术检测凋亡情况,Western blot检测凋亡及相关信号通路蛋白表达变化,实时荧光定量PCR技术检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)以及白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达变化.结果:化瘀解毒汤可抑制U266细胞的增殖活性,并诱导其发生凋亡,呈浓度及时间依赖性(r=-0.713,r=-0.827).化瘀解毒汤干预U266细胞48 h后,可下调抗凋亡蛋白Bcl-2、survivin的表达,并上调促凋亡蛋白Bax的表达,同时抑制TLR4/NF-κB信号通路的磷酸化水平.化瘀解毒汤干预U266细胞后,可显著降低HMGB1、IL-6 mRNA的表达,但对CXCR4 mRNA的表达基本无影响.结论:化瘀解毒汤能抑制U266细胞增殖活性并诱发程序性死亡,其分子机制可能与调控各凋亡蛋白表达以及抑制TLR4/NF-κB通路激活并下调HMGB1、IL-6 mRNA的表达有关.