目的:探讨谷氨酰胺对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其细胞信号机制。方法:采用实验研究方法。取10只7~8个月龄雌雄各半Wistar大鼠制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），另取20只7~8个月龄雌雄各半Wistar大鼠造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清，从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为正常血清组、烧伤血清组，加入相应血清培养。分别于培养1、3、6、9、12 h，采用锥虫蓝实验检测细胞存活率。将细胞分为单纯烧伤血清组、烧伤血清+4 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+8 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组，采用单纯烧伤血清或烧伤血清+相应终物质的量浓度谷氨酰胺处理，培养前实验筛选出的干预时间，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组，同前处理后采用蛋白质印迹法检测培养30 min哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）、p70核糖体蛋白S6激酶（p70 S6K）和真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）磷酸化水平。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组，行相应处理后，分别于培养1、3、6 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）和金属硫蛋白（MT）表达并观测微管形态。各组各时间点各指标样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:培养1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t=4.950、16.752、35.484、34.428、27.781， P<0.01）。与组内培养1 h比，烧伤血清组培养3、6、9、12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；与组内培养3 h比较，烧伤血清组培养6、9、12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；与组内培养6、9 h比较，烧伤血清组培养12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；烧伤血清组培养6、9 h细胞存活率比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。因此选择培养6 h作为后续烧伤血清干预时间。培养6 h，与单纯烧伤血清组比较，烧伤血清+4 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+8 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率均明显升高（ P<0.01）。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组与烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率相近（ P>0.05），烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组与烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率相近（ P>0.05）。因此选择12、16、20 mmol/L作为后续谷氨酰胺的干预浓度。培养30 min，正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平分别为1.001±0.042、0.510±0.024、0.876±0.022、0.836±0.074、0.856±0.041，1.00±0.11、0.38±0.09、0.95±0.13、0.96±0.13、0.89±0.24，1.00±0.07、0.29±0.08、0.87±0.27、0.68±0.08、0.60±0.21。与正常血清组比较，其余4个烧伤血清组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平均明显降低（ P<0.01） 。与单纯烧伤血清组比较，其余3个烧伤血清组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平均明显升高（ P<0.01）。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞4E-BP1磷酸化水平明显高于烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组和烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组（ P<0.05）。单纯烧伤血清组细胞培养1 h MT表达明显低于正常血清组（ P<0.05），其余时间点MT表达明显高于正常血清组（ P<0.01）；培养1、3、6 h，单纯烧伤血清组细胞HSP70表达明显高于正常血清组（ P<0.05），烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞HSP70和MT表达均明显高于单纯烧伤血清组（ P<0.05），烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组细胞HSP70和MT表达均明显低于烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组（ P<0.01）。正常血清组细胞培养1、3、6 h微管结构完整，呈网格排列，染色均匀。单纯烧伤血清组细胞培养1 h部分微管出现断裂，部分网格排列不齐；培养3 h靠近细胞核微管结构清晰，细胞核远端微管模糊不清；培养6 h微管结构模糊不清。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞培养各时间点微管破坏程度较单纯烧伤血清组轻。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组细胞培养各时间点微管形态与单纯烧伤血清组相近。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，细胞存活率明显下降。谷氨酰胺通过调控mTOR/p70 S6K/4E-BP1信号通路，促进心肌细胞HSP70和MT表达，稳定微管结构，从而发挥其细胞保护作用。

目的:探讨甘氨酸对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。取30只7~8周龄雌雄各半Wistar大鼠，其中10只用于制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），将另20只造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清；从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为用相应血清处理的正常血清组、烧伤血清组，于处理1、3、6、9、12 h进行锥虫蓝染色检测细胞存活率；将细胞分为用烧伤血清处理6 h后常规培养30 min的单纯烧伤血清组和用烧伤血清处理6 h后加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min的0.4 mmol/L甘氨酸组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组、2.0 mmol/L甘氨酸组，即干预6.5 h，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组，分别同前干预6.5 h，采用高效液相色谱法检测腺苷一磷酸（AMP）和ATP含量并计算AMP/ATP比值，采用蛋白质印迹法检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（p-mTORC1）、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶（p-p70 S6K）、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p-4E-BP1）、磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表达。将细胞分为同前干预的正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组和用烧伤血清处理后加2种试剂培养的0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组，于处理1、3、6 h行相应培养30 min，即干预1.5、3.5、6.5 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）、金属硫蛋白（MT）和微管蛋白表达并观察干预6.5 h微管形态。各时间点样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:处理1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t值分别为4.96、16.83、35.51、34.33、27.88， P<0.05）。在烧伤血清组中，处理3、6、9、12 h细胞存活率均较处理1 h明显降低（ P<0.05），处理6、9、12 h细胞存活率均较处理3 h明显降低（ P<0.05），处理6 h细胞存活率与处理9 h相近（ P>0.05）但明显高于处理12 h（ P<0.05）；选择处理6 h作为后续烧伤血清干预时间。干预6.5 h，与单纯烧伤血清组比较，各甘氨酸组细胞存活率均明显升高（ P<0.05）。0.8 mmol/L甘氨酸组细胞存活率最高，选择0.8、1.2、1.6 mmol/L作为后续甘氨酸的干预浓度。干预6.5 h，单纯烧伤血清组细胞AMP/ATP比值较正常血清组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组明显升高（ P值均<0.05），1.6 mmol/L甘氨酸组细胞AMP/ATP比值较0.8 mmol/L甘氨酸组明显降低（ P<0.05）。干预6.5 h，正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L 甘氨酸组、1.2 mmol/L 甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达水平分别为1.001±0.037、0.368±0.020、1.153±0.019、1.128±0.062、1.028±0.037，0.96±0.07、0.63±0.12、1.17±0.13、1.13±0.16、1.11±0.11，0.98±0.06、0.45±0.08、1.13±0.05、0.77±0.12、0.51±0.13。与单纯烧伤血清组比较，正常血清组与各甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K和p-4E-BP1蛋白表达均明显升高（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，1.2 mmol/L甘氨酸组细胞p-4E-BP1蛋白表达以及1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1与p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与1.2 mmol/L甘氨酸组比较，1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达明显升高（ P<0.05）。与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞干预1.5、3.5、6.5 h微管蛋白表达均明显降低（ P<0.05），干预1.5、3.5 h HSP70表达和干预3.5、6.5 h MT表达均明显升高（ P<0.05）；单纯烧伤血清组与0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞干预1.5、3.5、6.5 h HSP70、MT表达以及干预1.5、3.5 h微管蛋白表达均明显低于0.8 mmol/L甘氨酸组（ P<0.05）。干预6.5 h，与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞微管结构紊乱；0.8 mmol/L甘氨酸组细胞边界较单纯烧伤血清组清晰，微管结构近核部位排列整齐；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞边界不清，微管结构紊乱。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，甘氨酸可通过AMP活化蛋白激酶显著上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70核糖体蛋白S6激酶/真核翻译起始因子4E结合蛋白1信号通路，促进心肌细胞保护性蛋白HSP70、MT和微管蛋白合成，稳定微管结构，实现心肌细胞保护作用。

目的:研究二甲双胍干预对噪声性听力损失（NIHL）的保护作用及其差异蛋白质组学表达谱。方法:于2021年1月，将39只Wistar雄性大鼠随机分为对照组、噪声暴露组、二甲双胍+噪声暴露组，每组13只。噪声暴露组和二甲双胍+噪声暴露组大鼠连续暴露在声压级120 dB（A）、中心频率8 kHz的倍频程噪声下4 h；二甲双胍+噪声暴露组大鼠从噪声暴露前3 d开始给予200 mg/kg/d二甲双胍干预，共7 d。采用听性脑干反应（ABR）测试各组大鼠右耳噪声暴露前、噪声暴露后1、4、7 d的听力阈值变化情况，采用串联质谱标签（TMT）定量蛋白组学鉴定并分析各组大鼠内耳差异表达蛋白质，并用冰冻切片进行免疫荧光染色验证。结果:在噪声暴露后1、4、7 d，噪声暴露组和二甲双胍+噪声暴露组大鼠右耳短声ABR阈值明显高于对照组，二甲双胍+噪声暴露组大鼠右耳短声ABR阈值明显低于噪声暴露组（ P<0.05）。与噪声暴露组比较，二甲双胍+噪声暴露组大鼠差异表达上调蛋白1 035个，差异表达下调蛋白1 145个；GO富集分析显示，显著差异表达蛋白主要涉及结合、分子功能调节、信号转导等功能；KEGG通路富集分析发现，差异表达蛋白显著富集的通路包括磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、焦点黏附、糖尿病性心肌病、分裂体、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。免疫荧光实验显示，与噪声暴露组比较，二甲双胍+噪声暴露组胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）荧光强度增加，真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（eIF4EBP1）荧光强度减弱。 结论:噪声暴露可导致大鼠听力阈值升高，二甲双胍可通过多条通路和生物学过程改善噪声引起的听力阈值异常。

目的:观察微小RNA(miRNA，miR)-22-3p与真核翻译起始因子4E(eIF4E)的靶向关系，分析其对增殖的调控作用。方法:选择人正常成骨细胞株NHOst、骨肉瘤细胞株U20S(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)，应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞株中miR-22-3p的表达，采用双荧光素酶基因报告实验检测miR-22-3p与eIF4E结合情况。建立空白对照组、空载体转染组、miR-22-3p转染组、miR-22-3p和eIF4E共转染组，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的活性，采用蛋白质印迹法(Western blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(Cyclin D1)的表达。采用定量聚合酶链反应(qPCR)法检测miR-22-3p在23例骨肉瘤组织中的表达，采用免疫组织化学方法检测骨肉瘤组织中eIF4E、细胞核增殖抗原(Ki-67)的表达。组间定量资料的比较采用 t检验、方差分析(SNK法进行两两比较)，对数据行Spearman相关分析及K-M生存分析。 结果:骨肉瘤细胞株中miR-22-3p的表达明显低于正常成骨细胞株；双荧光素酶基因报告实验发现miR-22-3p能引起转染pGL3-eIF4E-WT的细胞中荧光素酶活性降低。与空白对照组及空载体转染组比较，miR-22-3p转染组细胞活性明显下降，PCNA和Cyclin D1的表达显著下降，miR-22-3p和eIF4E共转染组均能逆转上述表达水平。骨肉瘤组织中miR-22-3p表达范围是0.6～3.6，平均1.9±0.2，miR-22-3p与eIF4E、miR-22-3p与Ki-67均呈负相关( r＝－0.510、－0.530， P<0.05)，eIF4E与Ki-67呈正相关( r＝0.500, P<0.05)。miR-22-3p在不同肿物最大径、病变分级的分组中差异有统计学意义( P<0.05)，miR-22-3p与生存时间明显相关。 结论:miR-22-3p在骨肉瘤中低表达，靶向负调控eIF4E的表达，调节细胞的增殖。miR-22-3p可能是肿瘤进展及预后不良的危险因素。

目的:筛选泛素结合酶E2S(UBE2S)互作蛋白并构建肝细胞癌(HCC)基于UBE2S互作蛋白的预后模型(UIPM),分析 UIPM 评估 HCC患者预后的价值.方法:采用免疫共沉淀(Co-IP)技术筛选与Flag-UBE2S结合的蛋白复合体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting法验证后,采用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析鉴定UBE2S互作蛋白,并对互作蛋白进行基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析.采用R软件survival包筛选癌症基因组图谱(TGGA)中HCC预后相关蛋白与UBE2S互作蛋白取交集,通过LASSO回归分析从交集蛋白中获取关键蛋白构建UIPM,并建立预后模型风险评分公式,按照风险评分的中位值将TGGA中HCC患者分为高风险组和低风险组,通过受试者工作特征曲线(ROC)评估UIPM的预测准确性,并采用国际癌症基因组联盟(ICGC)数据库对UIPM预测准确性进行再次验证.采用单因素和多因素Cox回归分析评估UIPM风险评分是否为HCC的预后独立危险因素,并进一步构建列线图模型.结果:Co-IP联合LC-MS分析得到 97个UBE2S互作蛋白.GO功能和KEGG信号通路富集分析,互作蛋白主要与半胱氨酸型内肽酶活性、氧化应激和细胞死亡有密切关联.TCGA筛选出5 163个HCC预后相关蛋白,与UBE2S互作蛋白取交集,获得40个预后相关互作蛋白,LASSO回归分析得到 7个关键蛋白,包括UBE2S、热休克蛋白家族A成员 8(HSPA8)、异质性胞核核糖核蛋白H1(HNRNPH1)、含TCP1伴侣蛋白亚基3(CCT3)、真核翻译起始因子 2亚基 1(EIF2S1)、活化蛋白C激酶 1受体(RACK1)和肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基 4(ARPC4),并构建了UIPM,高和低风险组HCC患者生存率存比较差异有统计学意义(P<0.05).ROC曲线,UIPM预测HCC患者 1、2和 3年UIPM风险评分的ROC曲线下面积(AUC)值均大于0.7,表明预测模型准确度较高.ICGC数据库数据也证实UIPM预测准确度较高.单因素和多因素Cox回归分析,UIPM风险评分是HCC患者的独立预后危险因素(P<0.05).列线图预测HCC患者生存率与实际生存率之间有较好的一致性.结论:97个互作蛋白与UBE2S相互作用,可能通过氧化应激和铁死亡相关通路的失调促进HCC发生发展.UIPM风险评分是HCC预后的独立危险因素,可以用于预测HCC患者预后.而UBE2S、HSPA8、HNRNPH1、CCT3、EIF2S1、RACK1和ARPC4有望成为HCC新的生物标志物和治疗靶点.

目的 探讨转录激活因子Myb(C-myb)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白-1(4E-BP1)蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中的表达及与预后的关系.方法 回顾性选取2017年12月至2019年12月在秦皇岛市第一医院治疗的NK/T细胞淋巴瘤患者34例作为观察组,同时选取腺样体肥大组织30例作为对照组.采用免疫组织化学法检测C-myb、4E-BP1表达,比较两组患者C-myb、4E-BP1表达情况,分析观察组C-myb、4E-BP1表达与临床病理关系.采用Spearman秩相关分析C-myb和4E-BP1表达相关性.随访患者总体生存时间,分析C-myb、4E-BP1表达与预后的关系.结果 观察组C-myb和4E-BP1阳性表达率分别为55.88％和61.76％,明显高于对照组(10.00％、6.67％),差异均有统计学意义(P＜0.05).临床分期Ⅲ～Ⅳ患者C-myb阳性表达率为91.67％,明显高于Ⅰ～Ⅱ患者(36.36％),差异有统计学意义(P＜0.05);不同性别、年龄、原发部位、B症状、国际预后指数(IPI)指数及淋巴结侵犯患者C-myb阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).IPI指数≤2分患者4E-BP1阳性表达率为76.00％,明显高于IPI指数＞2分患者(22.22％),差异有统计学意义(P＜0.05);不同性别、年龄、原发部位、B症状、临床分期及淋巴结侵犯患者4E-BP1阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);C-myb和4E-BP1表达呈正相关(rs=0.642,P＜0.05);C-myb阳性表达和阴性表达患者中位总生存时间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);4E-BP1阳性表达患者中位总生存时间为24个月(95％CI:21.15～26.85),明显短于4E-BP1阴性表达患者的33个月(95％CI:32.20～33.80),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NK/T细胞淋巴瘤中C-myb和4E-BP1蛋白表达上调,与临床分期、IPI指数有一定关系,其中4E-BP1表达与患者预后可能有一定联系.

目的:研究蛋白激酶C β Ⅱ(protein kinase C β Ⅱ,PKCβⅡ)上调Snail和Twist蛋白表达介导上皮-间充质转化的分子机制.方法:采用[35S]-甲硫氨酸掺入实验和核糖体分离实验观察PKCβⅡ对Snail和Twist mRNA翻译的影响.敲减真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)通过核糖体分离实验、Western blot及RT-qPCR观察对PKCβⅡ调控Snail和Twist表达的影响.利用Western blot观察PKCβⅡ对调控eIF4E活性的相关信号通路的影响.利用Western blot观察应用丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶1(mitogen-activated protein kinase-interacting kinase 1,MNK1)抑制剂或雷帕霉素对PKCβⅡ调控Snail和Twist蛋白表达的影响.利用Transwell实验观察敲减eIF4E对PKCβⅡ调控肝癌细胞侵袭的影响.结果:[35S]-甲硫氨酸掺入实验和核糖体分离实验表明,相比β-actin,PKCβⅡ显著上调Snail和Twist mRNA的翻译(P<0.01).敲减eIF4E抑制PKCβⅡ介导的Snail和Twist mRNA翻译和蛋白表达的上调(P<0.01),但对Snail和Twist的转录没有影响.高表达PKCβⅡ激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/MNK1及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/eIF4E结合蛋白1(eIF4E-binding protein 1,4E-BP1)通路上调eIF4E的活性(P<0.01).应用MNK1抑制剂或雷帕霉素可抑制PKCβⅡ介导的Snail和Twist蛋白表达上调(P<0.01).敲减eIF4E抑制PKCβⅡ介导的肝癌细胞侵袭能力的增强(P<0.01).结论:PKCβⅡ通过激活ERK/MNK1通路和AKT/mTOR/4E-BP1通路上调eIF4E的活性,优先促进Snail和Twist mRNA的翻译,介导上皮-间充质转化,从而促进肝细胞癌的转移.这提示PKCβⅡ作为肝细胞癌治疗靶点的潜力.

目的:程序性坏死是一种由受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein 3,RIP3)和混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导的细胞死亡形式,有研究指出哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路可能参与程序性坏死的调控,真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,4EBP1)-真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)通路是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白最重要的下游分子通路之一,然而此通路是否参与程序性坏死的发生,目前尚无相关研究.本研究旨在探索4EBP1-eIF4E通路在程序性坏死中是否发生改变.方法:首先向小鼠上皮样成纤维细胞系L929细胞中加入程序性坏死诱导剂TSZ(TNF-α/SM-164/Z-VAD-FMK),在光学显微镜下观察细胞坏死情况;进一步向敲除RIP3和MLKL基因的L929细胞中加入TSZ,采用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色观察细胞坏死情况,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测4EBP1和eIF4E的mRNA和蛋白质表达水平.结果:野生型L929细胞用TSZ处理后,坏死细胞增加,4EBP1的mRNA和蛋白质表达水平明显下调且磷酸化的4EBP1(phosphorylated 4EBP1,p-4EBP1)/4EBP1值增加(P<0.05或P<0.01),eIF4E的mRNA表达水平明显上调且磷酸化的eIF4E(phosphorylated eIF4E,p-eIF4E)/eIF4E值增加(均P<0.01);在敲除L929细胞中的RIP3和MLKL基因后,PI阳性坏死细胞明显减少,4EBP1的mRNA和蛋白质表达水平明显上调且p-4EBP1/4EBP1值下降(P<0.05或P<0.01),eIF4E的mRNA表达水平明显下调且p-eIF4E/eIF4E值下降(均P<0.01).结论:4EBP1-eIF4E通路在RIP3/MLKL介导的程序性坏死中发生活化.

目的 探讨磷酸化的真核翻译起始因子结合蛋白(p-4E-BP1)在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征、预后的关系.方法 采用免疫组化染色检测164例患者结直肠癌组织中p-4E-BP1表达,采用qRT-PCR、Western bolt法检测结直肠癌组织及其癌旁正常组织中4E-BP1、p-4E-BP1的mRNA、蛋白表达,应用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型对结直肠癌患者进行生存分析.结果 164例结直肠癌患者中p-4E-BP1均有表达,其中低表达69例(42.1％),高表达95例(57.9％).p-4E-BP1表达与结直肠癌患者的肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均有关,其中细胞分化较差、浸润较深、淋巴结转移、TNM分期较晚的结直肠癌患者p-4E-BP1表达均较高(均P＜0.05).结直肠癌组织中4E-BP1 mRNA、蛋白表达与癌旁正常组织比较,差异均无统计学意义(均P ＞0.05);而p-4E-BP1蛋白表达较癌旁正常组织明显增高(P＜0.05).p-4E-BP1高表达组无进展生存期、总生存期均明显短于低表达组(均P＜0.05).p-4E-BP1蛋白表达是影响患者术后总生存期、无进展生存期的独立风险因素(RR=5.414、4.754,均P＜0.05).结论 p-4E-BP1高表达与肿瘤进展以及不良预后相关,p-4E-BP1可作为临床判断结直肠癌患者预后的一个新指标.

目的 研究华蟾素对U87胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响,并初步探讨其中的分子机制.方法 不同浓度的华蟾素(0.5～20 μmol/L)处理U87细胞6h、12 h、24 h、48 h后,用CCK-8试剂盒进行做细胞活性检测,观察华蟾素对U87胶质瘤细胞活性的影响.不同浓度的华蟾素(1～20 μmol/L)分别处理12 h、24 h后,用Hochest33342试剂检测U87胶质瘤细胞的凋亡情况.免疫荧光染色观察华蟾素处理24 h后与细胞增殖相关蛋白p-AKT(T308)的表达情况.Western blot检测不同浓度的华蟾素(1～20 μmol/L)处理24 h后与细胞增殖相关蛋白{磷酸化的磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、苏氨酸308位点磷酸化的蛋白激酶B[p-AKT(T308)]、丝氨酸473位点磷酸化的蛋白激酶B[p-AKT(S473)]、磷酸化核糖体S6蛋白激酶(PS6)、磷酸化的真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1 (p-4EBP1)}和凋亡相关蛋白(BAX、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9)的表达情况.结果 华蟾素可抑制U87胶质瘤细胞的活性、诱导U87胶质瘤细胞的凋亡,呈浓度和时间依赖性反应.华蟾素作用后可使凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3、BAX的表达水平增高,PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT(T308)的表达水平降低.结论 华蟾素可抑制U87胶质瘤细胞的增殖、诱导U87胶质瘤细胞的凋亡,这可能经由影响PI3K-AKT-4EBP1与BAX-caspase的信号通路实现.